[发明专利]一种羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法。

背景技术

羊泰勒虫病(Ovine And CaprineTheileriosis)是由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称，属于一种由媒介蜱传播的蜱传性血液原虫病(Neitz W O 1957，Barnett S F 1977，Morel P C et al,1981)。泰勒虫于1914年第一次在埃及被发现(Littlewood 1915)，而中国最早于1958年由杨辅国等报道了四川的羊泰勒虫病(Yang et al，1958)。该病能引起山羊和绵羊发热、贫血症和黄疸等临床症状，使羊只发育迟缓，产肉量和产毛量显著下降，并可引起羔羊和外来羊只大量死亡，从而限制了地方性养羊业的发展和生产，到目前为止，已有六种羊泰勒虫被报道，分别为致病力较强的莱氏泰勒虫(Theilerialestoquardi)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)和尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)，以及对羊致病力很弱或无致病性的绵羊泰勒虫(T.ovis)、分离泰勒虫(T.separata)和隐藏泰勒虫(T.recondita)。其中T.luwenshuni、T.uilenbergi和T.ovis均在国内被发现。根据报道，我国东南地区、西北地区和中部地区的山羊和绵羊均有T.luwenshuni感染。

嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum，AP)于1932年在苏格兰地区首次被发现，引起了羊的不明发热，由于发现该病与牧草中的蜱虫有关，将其称为蜱传热病(TBF)。由A.phagocytophilum引起的人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis,HGA)是人兽共患病，最初该病原被称为人粒细胞埃立克体，后来将其重新分类归属于立克次体目，无浆体科，无浆体属，更名为人粒细胞无浆体(A.phagocytophilum)，A.phagocytophilum具有广泛的宿主群，包括人类、野生动物和家畜等，是对人和动物都有较强致病性的人畜共患病原体，属于自然疫源性疾病，可引起反刍动物的急性和慢性传染病，A.phagocytophilum能诱导机体立即产生炎症反应和免疫反应，介导免疫活性细胞及炎性因子对宿主细胞的攻击，最终导致免疫抑制及潜在疾病引起的各种继发感染和器官衰竭，患病特征主要表现为胆囊肿大、贫血、黄疸、高热、消瘦，严重者甚至可以导致死亡。

A.phagocytophilum作为一种人和多种动物的人兽共患病病原，具有公共卫生学意义，受到人们的高度重视，嗜吞噬细胞无浆体病的发生呈季节分布，主要发生在媒介硬蜱活动期间，在中国部分地区硬蜱、森林革蜱、长角血蜱等都是嗜吞噬细胞无形体的传播媒介，易感动物和人经感染幼蜱叮咬造成感染传播。我国2006年在安徽省报告发现HGA病病例，此后在山东、湖北、河南、浙江等省陆续有发病报道，在安徽、湖北等省家畜中都检测到A.phagocytophilum，在新疆伊犁地区也有家畜感染该病的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物，引物的核苷酸序列为：

羊吕氏泰勒虫专用引物T.lu7：

T.lu7F：5’-TGCTGCATTGCATCTTCT-3’，如SEQ NO.1所示；

T.lu7R：5’-AGGGACGTAATCTGCACAAG-3’，如SEQ NO.2所示；

嗜吞噬细胞无浆体专用引物SSAP2：

SSAP2F：5’-GCTGAATGTGGGGATAATTTAT-3’，如SEQ NO.3所示；

SSAP2R：5’-ATGGCTGCTTCCTTTCGGTTA-3’，如SEQ NO.4所示。

所述羊吕氏泰勒虫专用引物T.lu7的扩增产物大小为962bp，嗜吞噬细胞无浆体专用引物SSAP2的扩增产物大小为641bp。

利用上述的羊吕氏泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体双重PCR专用引物进行双重PCR检测的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)将引物对T.lu7和SSAP2分别配置成浓度为25μM/L的溶液；