[发明专利]一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，其特征在于，包括能检测人体肝特异的试剂，所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括APOA5基因甲基化转化试剂和甲基化保护试剂、DNA聚合酶；

所述甲基化保护试剂与所述甲基化转化试剂的体积比例为1:5～6。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液；

其中，所述DNA聚合酶、所述引物、所述dNTP、所述缓冲液的体积比例为0.2～0.3:4:3～6:4～6。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述引物APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R等体积混合。

6.权利要求1-5所述的试剂盒在血液检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括以下步骤：提取待检测者血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测的方法还包括：采集身体正常的检测者的血液，提取血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳，制得正常人琼脂糖胶胶图；采集待检测者的血液，制得琼脂糖胶胶图，与所述正常人琼脂糖胶胶图比较。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化转化条件为：在DNA提取液内添加DNA甲基化保护剂，DNA甲基化转化剂，所述甲基化保护剂与所述甲基化转化剂的使用比例为3:17。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述血液检测具体步骤为：

1)用抗凝管采集外周静脉血，首先以1000～2000转/分钟的转速离心后取出上清液，再以10000～20000转/分钟的转速离心，取上清液，使用DNA提取试剂提取游离DNA，溶于水中，得DNA提取液；所述DNA提取试剂为QIAGEN或CWhipro Circulating DNA Midi Kit中的一种；

2)在DNA提取液中加入DNA甲基化保护剂，使用DNA甲基化试剂对游离DNA进行甲基化转化；所述DNA甲基化保护剂与所述DNA甲基化转化剂的体积比例为3:17；DNA甲基化转后后，将甲基化DNA进行清洗。

3)将甲基化DNA用所述引物和DNA聚合酶进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；

其中所述DNA聚合酶与所述引物的体积比例为1:15。