[发明专利]一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用。

背景技术

DNA甲基化发生在5'-胞嘧啶位置，主要处于5'-CG-3'核苷酸模式中，通过将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，以活性甲基取代CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5'位置的氢，从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-m C)。甲基胞嘧啶是对哺乳动物基因组DNA唯一的一种化学修饰。作为最重要的表观遗传机制，它在一个新水平揭示了基因组多样性，即：不同组织不同细胞的基因表达，在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段有不同的甲基化水平。基因组DNA上各CpG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱。由于DNA甲基化模式形成过程中呈现的异质性以及组织特异性差异甲基化区域(tissue specific differentially methylated regions，tDMRs)的发现，DNA甲基化也开始被逐渐应用在法医学的相关领域。比如在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化，呈现亲源依赖的等位基因甲基化模式。亲源特异性甲基化在细胞世代间的传递。在病理情况下，组织细胞的DNA甲基谱发生特异性的改变。DNA甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用，可望用于肿瘤早期诊断和类型甚至亚型的区分，例如胃癌、肺癌、前列腺癌症。

DNA甲基化检测方法飞速发展，高通量测序技术、芯片技术进行全基因组甲基化检测，定量的甲基化质谱检测技术越老越多的技术应用于甲基化研究。随着分子生物学技术特别是高通量测序技术的发展，研究人员从几个位点甲基化到系统地研究甲基化。本专利是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含能检测人体肝特异的试剂。人体有一肝特异的甲基化位点，通过检测，可对肝癌患者进行监测，特别是肝癌早起和肝癌复发患者。

所述试剂包含在APOA5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。

所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R。

所述引物具体如下：

APOA5-M-F：TTTATGGGGTAAATTATTATTTTACGT

APOA5-M-R：CCTAAAAACTTCACTTACAAATTTCCG

APOA5-U-F：TTTTTTTTATGGAGGTAAATTTTATTATTT

APOA5-U-R：TAAAAACTTCATCTACAAATTCCTACA。

本发明进一步提出地，所述试剂盒还包括APOA5基因甲基化转化试剂和甲基化保护试剂；

所述甲基化保护试剂与所述甲基化转化试剂的使用比例为1:5～6；

优选地，所述甲基化保护试剂可选用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH)、EpiTect Fast DNA Bisulfite Kite(QIAGEN)中的一种；

优选地，所述甲基化转化试剂可选用CT Conversion Reagent(Cat No.D5001-1)(ZYMO RESEARCH),、Bisulfite Solution(Lot No.154016700)或DNA Protect Buffer(Lot No.154024444,QIAGEN)中的一种；

本发明进一步提出地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP及缓冲液；

其中，所述DNA聚合酶、所述引物、所述dNTP、所述缓冲液的体积比例为0.2～0.3:4:3～6:4～6。

所述DNA聚合酶可选用TaKaRa Ex Taq。

本发明进一步提出地，所述引物APOA5-M-F、APOA5-M-R、APOA5-U-F、APOA5-U-R等体积混合。

本发明的第二个目的在于，权利要求1-4所述的试剂盒在血液检测中的应用；具体地，在检测人体APOA5基因是否是肝癌样本的应用。

所述检测的步骤包括：提取待检测者血液中游离DNA，进行DNA甲基化转化；将甲基化DNA用所述引物进行PCR扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；判断待检测者是否是肝癌样本。