[发明专利]一种里氏木霉工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明将外源的来自黑曲霉的、具有较好pH耐受性的葡萄糖氧化酶基因(god)转化入里氏木霉并将其表达，得到可表达外源葡萄糖氧化酶的转化子TU6god，再在该转化子中过表达内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白基因(snc1)，从而筛选到一株葡萄糖氧化酶的活性比出发菌株酶活显著提高的转化子Tu6god‑snc。Tu6god转化子在MM‑Avicel中培养32h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到0.28U/ml；而Tu6god‑snc在MM‑Avicel中培养44h后，其葡萄糖氧化酶酶活达到了0.61U/ml，相较于Tu6god，其GOD酶活提高了121％，而出发菌株Tu‑6中，不能测定到葡萄糖氧化酶酶活。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种里氏木霉工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)具有生物安全性高和易于培养的优点，其胞外纤维素酶系统由60％～80％的外切葡聚糖苷酶，20％～36％的内切葡聚糖苷酶和1％的β-葡萄糖苷酶组成，这些酶协同作用，将纤维素转换成葡萄糖。里氏木霉具有良好的安全性，已长期应用于食品加工业，是公认的GRAS(Generally regarded as safe)菌和美国FDA认证的食品安全菌株。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟、发酵成本低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础，但里氏木霉自身并不能分泌表达葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)的系统名称为β-D-葡萄糖:氧1-氧化还原酶(EC1.1.3.4)，可从许多来源的真菌中分离、纯化得到，这些真菌主要为曲霉和青霉属，其中用来生产GOD的主要是黑曲霉。GOD能够催化β-D-葡萄糖被分子氧氧化生成葡萄糖酸-δ-内酯，并生成过氧化氢。生成的葡萄糖-δ-内酯随后自发水解或者在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶具有广泛的应用价值，可用于葡萄糖生物传感器制造(测血糖等)、作为面粉添加剂替代溴酸钾、生产葡萄糖酸及其盐、制备生物燃料电池及饲料添加剂等领域。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种产葡萄糖氧化酶的里氏木霉，所述里氏木霉含有葡萄糖氧化酶的编码基因god。

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god是通过表达载体导入所述里氏木霉的；

所述葡萄糖氧化酶的编码基因god来源于黑曲霉；再具体的，所述葡萄糖氧化酶的编码基因god的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：2第26-1896位核苷酸序列。

具体的，所述里氏木霉还过表达内源的与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1。

所述过表达包括通过表达载体将所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1导入所述里氏木霉的

所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1来源于里氏木霉；再具体的，所述与蛋白分泌到胞外相关的蛋白的编码基因snc1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸。

具体的，所述里氏木霉含有重组质粒pRS424-cbh1P-god-cbh1T；和/或所述里氏木霉含有重组质粒pRS424-pdc1P-snc1-pdc1T；

所述重组质粒pRS424-cbh1P-god-cbh1T为将序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列的第38-1787位核苷酸、SEQ ID №：2所示核苷酸序列的第26-1896位核苷酸、SEQ ID №：3所示核苷酸序列的第26-1525位核苷酸插入pRS424质粒的EcoRI酶切位点后获得的；

所述重组质粒pRS424-pdc1P-snc1-pdc1T为将序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的第26-1521位核苷酸、SEQ ID №：6所示核苷酸序列的第26-700位核苷酸、和SEQ ID№：7所示核苷酸序列的第26-1025位核苷酸插入pRS424质粒的EcoRI酶切位点后获得的。