[发明专利]蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种在蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测中应用的探针及引物，其特征在于，所述探针为两条探针，一条探针5′端采用FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团；一对幼虫芽孢杆菌引物P.larvae F/P.larvae R SEQ ID NO：1和一条探针P.larvae P SEQ ID NO：2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M.pluton F/M.pluton R SEQ ID NO：3和一条探针M.pluton P SEQ ID NO：4；

所述探针及引物在蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测中的应用流程为：

DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；

对照设置：幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

25μL PCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixEx Taq 12.5μL，P.larvae F 1μL，P.larvae R 1μL，P.larvae P 1μL，M.pluton F 1μL，M.pluton R 1μL，M.pluton P 1μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH₂O 5.5μL，使反应总体积为25.0μL；

PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、59℃退火延伸50s，共40个循环，退火延伸时收集荧光信号；

结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，对分别只单独使用幼虫芽孢杆菌DNA或蜂房蜜蜂球菌DNA或其阳性质粒，则各管对应只出现FAM或VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值都分别≤35.0，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品有FAM和VIC荧光同时被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，判定为阳性，表明从样品中同时检出幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌，只有FAM荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出幼虫芽孢杆菌，只有VIC荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出蜂房蜜蜂球菌，无FAM或VIC荧光被检出，且无扩增曲线，无Ct值，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值35.0的样品重新检测，重新检测结果无FAM或VIC荧光被检出，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌，重新检测结果有FAM或VIC荧光被检出，判定为阳性，表明从样品中检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌。