[发明专利]蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明属于病原检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5′端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团。本发明的方法与其它病原无交叉反应；对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10拷贝/μL的阳性质粒；重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2％。

技术领域

本发明属于病原检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。

背景技术

蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American Foulbrood，AFB)和欧洲幼虫腐臭病(EuropeanFoulbrood，EFB)，是蜜蜂幼虫两种重要的细菌性疾病，病原体分别为幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae，P.larvae)和蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton，M.pluton)，呈世界性分布，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病，是我国转地养蜂和世界各国在进境蜂及蜂产品中重点检疫的两种蜜蜂疫病。P.larvae在一定条件下能产生芽孢，具有特别强的生存能力，病原很难控制和净化；M.pluton虽不产生芽孢，但对外界不良环境的抵抗力强，能在蜂尸上存活数年，在蜂蜜里也能保持长久的毒性，传染性极强。AFB和EFB均感染和危害蜜蜂幼虫，且病症相似，易发生误诊，因此开展对AFB和EFB的同步鉴别及早期诊断研究具有重要意义。目前，AFB和EFB的实验室诊断方法主要包括细菌涂片镜检、分离培养、凝集试验和核酸检测等方法，已有诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，由于幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，上述诊断方法很难对美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病做出准确诊断和推广应用，已报道的AFB和EFB多重PCR诊断方法为普通PCR，该方法只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质，已报道的荧光定量PCR均为单重PCR方法，无法实现在同一反应管中同时检测两种病原的目的，国内外未见有AFB和EFB病原菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的报道。

综上所述，现有技术存在的问题是：

1.分离培养、凝集试验等方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，对该病很难做出准确诊断，诊断方法也很难推广应用。

2.国外在AFB和EFB的实验室诊断方面建立了多种PCR方法，但我国缺少具有自主知识产权的快速、准确、高通量、易于推广的PCR方法，不利于我国蜜蜂疫病的防控。

3.目前，已建立的AFB和EFB多重PCR诊断方法为普通PCR，只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质。

4.目前，已建立的AFB和EFB荧光定量PCR均为单重PCR方法，无法实现在同一反应管中同时检测两种病原的目的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。

本发明是这样实现的，一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5′端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团。

进一步，具体检测流程为：

1、DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；