[发明专利]制备小鼠再细胞化肝脏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程领域，具体涉及一种制备小鼠再细胞化肝脏的方法。

背景技术

目前，器官移植是治疗器官衰竭唯一有效的方法，对于合适器官移植的迫切需求远远超过可利用的器官数量。大量器官衰竭的患者因等待供体的时间过长，在等待的过程中结束了生命。因此，供体器官缺乏严重制约了器官衰竭患者的临床治疗，降低了患者的总体生存期。为了寻求其他替代治疗方法，以组织工程和再生医学为基础的研究显得尤为重要，使得将来为广大患者提供可供移植的实质性器官成为可能。

在终末期肝病的治疗中，肝脏供体来源不足严重制约了肝脏移植的发展。在肝脏替代治疗的研究中，再细胞化肝脏的制备与应用拓宽了肝脏替代治疗的研究领域。以肝脏生物支架为载体制备再细胞化肝脏，从形态学与功能学两个方面成功模拟正常肝脏，在未来将其运用于手术移植的替代治疗防范具有重要意义。

利用正常的肝脏进行一系列去细胞化处理，就可获得完整的肝脏生物支架，此方法不仅可以去除大量的细胞和核性物质，还保留了支架内细胞外基质和超微脉管结构。细胞外基质成分通常由组织器官固有的细胞合成与释放，且与周围外部环境保持动态平衡。肝内微脉管结构为种子细胞提供支架，模拟肝内生长环境，维系细胞间交互作用。因此，肝脏生物支架是一种理想的细胞载体。在此基础上制备的小鼠再细胞化肝脏较其他生物合成材料所制备的再细胞化肝脏相比较，具有更优秀的生物学效应。但是在制备的过程中，因其植入的细胞数量，灌注方式，灌注时间等不同决定了再细胞化肝脏发挥的效能不同。

通过实验摸索我们发现：(1)灌注细胞数量方面。灌注过多的细胞进入肝脏，可使细胞营养供给不足，最终凋亡；灌注细胞过少，不仅降低了细胞基数，也不能建立有效的细胞间联系。(2)灌注通道方面。以灌注通过分类可分为经门静脉、肝动脉、肝静脉灌注。验证发现经肝动脉灌注易因高压而发生灌注液漏，肝静脉逆行灌注细胞不易弥散进入脉管系统。(3)灌注次数方面。一次性灌注与分次灌注相比较，在注入同样数量肝细胞的基础上，分次灌注所制备的肝脏发挥更好的肝脏功能。因此，如何通过改进上述实验方法提高再细胞肝脏生物学效能是目前构建再细胞化肝脏亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备小鼠再细胞化肝脏的方法。

本发明通过下述技术方案实现：

制备小鼠再细胞化肝脏的方法，包括以下步骤：

(1)在灌注系统中加入灌注液，灌注液包含：DMEM培养基，且在培养基中加入有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素；

(2)将灌注液以5mL/min的速度灌注到肝脏生物支架中，灌注时间30min，其中，灌注液经门静脉注入肝脏生物支架，从肝下下腔静脉流出；

(3)停止灌注，向灌注液中缓慢注入5×10⁶个细胞(溶于3mL灌注液)，按1mL/min的速度将带有细胞的灌注液注入肝脏生物支架中；

(4)将灌注液以10mL/min的速度灌注肝脏生物支架10min；

(5)重复步骤(3)和(4)4次，即得再细胞化肝脏。

进一步地，所述肝脏生物支架的制备方法如下：

A、经离体肝脏的门静脉灌注含12.5U/ml肝素的磷酸缓冲盐溶液，其中，以5ml/min的速度灌注10min；

B、将离体肝脏在-80℃的条件下放置24h；

C、将冰冻肝脏在室温条件下解冻，然后将磷酸缓冲盐溶液以1ml/min的速度经门静脉灌注1h；

D、将1％的十二烷基硫酸钠溶液以5ml/min的速度经门静脉灌注1h；

E、将1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶以5ml/min的速度经门静脉灌注2h；

F、将1×磷酸缓冲盐溶液以5ml/min的速度经门静脉灌注2h；

G、将含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液以5ml/min的速度经门静脉灌注20min，即得肝脏生物支架。

再进一步地，步骤G还包括用含青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗肝脏表面。

更进一步地，每次灌注均是以肝下下腔静脉作为液体的出口。

另外，每次灌注均通过在离体肝脏门静脉中置管的方式进行灌注。

此外，每次灌注均是在操作皿中完成。

本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明的方法所灌注的总体肝细胞数量可达到20×10⁶，是发明人经过研究后的结果，最适宜小鼠再细胞化肝脏的中肝细胞的生长与肝脏功能的表达。