[发明专利]一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法

权利要求书

1.一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，是采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。

2.根据权利要求1所述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ No.1所示。

3.根据权利要求1或2所述一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用BamHI/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9 cDNA连接入逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒，成功构建的质粒命名为VIR-MLL-AF9；

dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控，载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止；

2）将VIR-MLL-AF9质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86，获得条件性表达MLL-AF9融合基因的逆转录病毒；所述细胞系GP+E-86包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域；

3）将10-12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg处理，获取骨髓后在IMDM培养基中培养48小时，培养基中添加10%胎牛血清，0.15mM的MTG，100 ng/mL 的SCF，10ng/mL的IL-6和10ng/mL的IL-3；

4）用含有4μg/mL Polybrene的逆转录病毒上清液转导步骤3）所述骨髓细胞，室温，转速2000rpm离心90分钟，将细胞转移至培养箱孵育6小时后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，培养48小时，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+细胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分选出的细胞培养于步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，并添加1μg/mL的Doxycycline；最后存活的细胞即为永生化的小鼠髓系细胞。