[发明专利]一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法。

背景技术

MLL-AF9融合基因在婴儿与髓系和淋巴系侵袭性白血病都有相关性，而在成体，这种易位主要与急性髓系白血病相关。这些结果暗示在胚胎和成体组织白血病发展的细胞来源方面存在差异。我们猜测细胞来源的内在特性在决定白血病的谱系方面扮演了重要角色。

事实上，新生儿CD34⁺细胞表达MLL-AF9可永生化为髓系或淋巴系细胞，而成体骨髓CD34⁺细胞的永生化更难以实现，且具有强烈的髓系偏好性。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法。

本发明技术方案的设计思路为：

为获得具有永生化能力的小鼠血液髓系细胞，申请人在来源于成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达MLL-AF9融合基因。这种策略产生了克隆化的并依赖于细胞因子的髓系细胞系。由于正常的髓系细胞本身并不表达MLL-AF9，在血液细胞中异位表达MLL-AF9可能会改变这些细胞，改变原代髓系细胞的某些生物学特性。为克服这一缺陷，申请人拟采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline来诱导MLL-AF9基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系；而在这些永生化的髓系细胞用于生物学功能实验前，撤销Doxycycline，终止MLL-AF9基因的表达。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，是采用Tet-On诱导型逆转录病毒载体，通过添加Doxycycline以诱导MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达，获得髓系细胞系。

进一步的，上述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ No.1所示。

进一步的，上述的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1）用BamHI/XhoI双酶切从TtRMPVIR质粒上切下dsRed基因片段，并将带BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9 cDNA连接入逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒，成功构建的质粒命名为VIR-MLL-AF9；

dsRed基因的表达受四环素调节元件TREtight严格调控，载体组成型表达反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下发生构象变化，激活四环素调节元件TREtight，启动下游基因的表达；撤销Doxycycline，则下游基因的表达终止；

2）将VIR-MLL-AF9质粒转染逆转录病毒包装细胞系GP+E-86，获得条件性表达MLL-AF9融合基因的逆转录病毒；所述细胞系GP+E-86包含莫罗尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env区域；

3）将10-12周龄的C57BL/6小鼠在获取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg处理，获取骨髓后在IMDM培养基中培养48小时，培养基中添加10%胎牛血清，0.15mM的MTG，100 ng/mL 的SCF，10ng/mL的IL-6和10ng/mL的IL-3；

4）用含有4μg/mL Polybrene的逆转录病毒上清液转导步骤3）所述骨髓细胞，室温，转速2000rpm离心90分钟，将细胞转移至培养箱孵育6小时后，弃去含Polybrene的的逆转录病毒上清液，更换为步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，培养48小时，用流式细胞仪分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+细胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分选出的细胞培养于步骤3）所述的添加有各种成分的IMDM培养基，并添加1μg/mL的Doxycycline；最后存活的细胞即为永生化的小鼠髓系细胞。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种永生化小鼠髓系细胞系的制备方法，通过条件性表达MLL-AF9获得的永生化的髓系细胞系（图2右侧）和成年小鼠骨髓中的原代髓系细胞（图2左侧）相比，具有相似的表面标志物，即CD11b⁺，但永生化的髓系细胞系极易扩增，获得大量均一的细胞群体。

附图说明

图1显示为逆转录病毒载体TtRMPVIR质粒的图谱。

图2显示为永生化的髓系细胞系在髓系细胞生长因子作用下的分化情况。

图3 显示为永生化的髓系细胞系在Giemsa染色后镜下观察细胞核的特点。