[发明专利]抗除草剂蛋白及其基因在植物育种中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体而言，本发明涉及能赋予植物除草剂抗性的蛋白氨基酸序列及其在植物育种中的应用。

背景技术

农田中杂草是影响农作物产量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高，而且不便于农业集约化生产，严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此，除草剂就运应而生，其使用为解决农田草害、促进栽培方式的革新及增产中起了很大的作用。

目前发展抗除草剂作物的途径主要有两种：一种是通过转基因手段将抗除草剂基因转入作物中，最成功的案例是美国孟山都公司开发的一系列转基因抗草甘膦除草剂作物品种农达 (Roundup)系列，包括抗农达大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵和甜菜。但是利用转基因基因技术培育的抗除草剂的作物品种需要经过较长时间的安全性评价，而且，从品种选育成功到生产应用的周期较长。第二种是利用遗传学非转基因的手段筛选作物抗除草剂突变体。该方法代表了目前国际抗除草剂作物培育的新方向。首先通过遗传诱变的方法构建突变体库，从中筛选到抗除草剂突变体，这样得到的突变体可以直接作为抗除草剂新品种加以利用，或通过回交转育的方法杂交到其他栽培品种。其优点是非转基因作物，不需要经过安全评估直接应用，产业化所需的批准时间短。因此我们选择了后者作为获得抗除草剂作物的方法。

乙酰羟基合成酶(AHAS，EC2.2.1.6)或者叫乙酰乳酸合成酶(ALS)是支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成途径的第一个酶，也是几种重要除草剂的靶位点，主要包括：咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂和磺酰基氨基羧基三唑啉酮类除草剂。这五类除草剂与其靶位点乙酰羟基合成酶结合后，能够抑制蛋白活性，从而阻止易感植物的生长发育。在模式植物拟南芥中的研究表明， AHAS蛋白某些氨基酸突变后能够使拟南芥获得除草剂抗性，突变后的蛋白不再与除草剂结合，同时又保持原有的生物学活性。

正是基于以上原理，本发明人通过长期而艰苦的研究实践，在玉米作物中构建了突变体库，并从中筛选到一系列抗除草剂突变体，并鉴定出赋予其除草剂抗性的蛋白。本发明人还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如抗除草剂玉米、水稻、小麦、高粱等。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的使植物具有除草剂抗性的蛋白质氨基酸序列和核苷酸序列，弥补原有专利或技术的不足。另外，本发明还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体(如，表达盒、载体和细胞等)，获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用，并且提供了判断植物是否采用本发明方法或提供的抗性蛋白获得抗性的鉴定方法。

具体而言，本发明提供了一种对乙酰羟酸合酶(Acetohydroxy acid synthase，AHAS) 类抑制剂具有耐受性的突变体植株，所述突变体植株的基因组DNA发生了突变，与野生型对照相比，突变位点发生在AHAS基因编码框的第1862bp，该位点发生了由G到A的点突变，从而导致该基因编码的蛋白质第621位氨基酸由丝氨酸(Ser，S)变为天冬酰胺(Asn，N)，具有该突变位点的植株可以耐受AHAS抑制剂类除草剂。

在本发明中，AHAS抑制剂类除草剂包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂(Peter Babczinski,Thomas Zelinski.Mode of action herbicidal ALS-inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures，yeast，and Escherichia coli.Pesticide science,1991,31:305-323；郑培忠,沈健英.乙酰乳酸合成酶抑制剂的种类及其耐药性研究进展.杂草科学,2009,2:4-8)。因此，在本发明中除草剂抗性指的是对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类在内的除草剂具有耐受性。优选在本发明中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，如在本发明的具体实施方式中，除草剂是咪唑乙烟酸。即优选在本发明中，除草剂抗性是咪唑啉酮类除草剂抗性，更优选是咪唑乙烟酸抗性。