[发明专利]一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法

权利要求书

1.一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA；

(2)循环游离DNA的富集：将水相和油相混合、振荡配成PCR反应体系并进行乳液PCR扩增，分离水相和油相，得到水相的PCR扩增产物，使用特异性结合循环肿瘤DNA的探针序列捕获所述水相的PCR扩增产物中的循环肿瘤DNA；

(3)配置数字PCR反应体系：

配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及双蒸水，上述配合的比例关系为0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述PCR模板为步骤(2)中PCR扩增产物；

配制PCR油相，将65％-68％的甘油、5％-10.5％的Trition X-100、5％-10.5％的司盘60、5％-8％的壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

取1体积水相加到3体积的油相中，涡旋搅拌并反应后，得到油包水微滴PCR反应体系；

(4)PCR扩增反应：将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后设定PCR反应条件进行PCR扩增，扩增后将96孔PCR板置于QX100A微滴分析仪中，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。

2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的水相中含有循环游离DNA模板、正反向引物、dNTPs、PCR缓冲液和DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶为高保真的Klenow Fragment、KAPA HiFi家族高保真DNA聚合酶、Phusion家族高保真DNA聚合酶、Q5家族高保真DNA聚合酶中的任一种。

4.根据权利要求2所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述水相DNA模板总量1-10ng、正反向引物终浓度为0.1-1μM、dNTPs终浓度为0.5-2mM、PCR缓冲液终浓度为1倍、DNA聚合酶终浓度为0.1-1U。

5.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述探针序列与所述循环肿瘤DNA特异性结合以后，通过链霉亲和素磁珠特异性结合生物素而捕获所述循环肿瘤DNA。

6.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括Illumina测序仪中使用的测序接头序列，所述测序接头序列对应的正反向引物序列分别为

5’-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3

和5’-TGAACCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’。

7.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中得到的油包水微滴的粒径为100nm～1μm。