[发明专利]一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液循环DNA测定技术领域，具体涉及一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法。

背景技术

血液循环DNA(Circulating DNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-free DNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，可以被定性、定量和追踪。对于这类ctDNA的成功捕获，携带信息的准确解读为癌症早期基因信息的获取，癌症的早期诊断、预后检测、耐药评估提供了一条准确的途径。

但是，这类技术目前仍未得到有效解决和广泛应用。原因之一在于：ctDNA在外周血中的含量非常低，尤其是与正常DNA(normal DNA，nDNA)相比，其相对含量极低，每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游离DNA，目前的检测技术还难以达到直接检测外周血中ctDNA的水平。而且，目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。

1999年Vogelstein首次提出了“数字PCR”的概念，“数字PCR”以其极高的敏感性、绝对计算能力和无需定标等特性疾病诊断工作中得到了广泛应用。数字PCR是通过对样本进行微小单元化处理，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且数字PCR不依靠任何校准物或外标便可直接计数目标分子数，为绝对定量PCR技术。因此数字PCR(digital PCR)特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，大大提高了检测的精确性和灵敏度。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA；

(2)循环游离DNA的富集：将水相和油相混合、振荡配成PCR反应体系并进行乳液PCR扩增，分离水相和油相，得到水相的PCR扩增产物，使用特异性结合循环肿瘤DNA的探针序列捕获所述水相的PCR扩增产物中的循环肿瘤DNA；

(3)配置PCR数字PCR反应体系

配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及双蒸水，上述配合的比例关系为0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述PCR模板为步骤(2)中PCR扩增产物；

配制PCR油相，将65％-68％的甘油、5％-10.5％的Trition X-100、5％-10.5％的司盘60、5％-8％的壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

取1体积水相加到3体积的油相中，涡旋搅拌并反应后，得到油包水微滴PCR反应体系；

(4)PCR扩增反应：将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后设定PCR反应条件进行PCR扩增，扩增后将96孔PCR板置于QX100A微滴分析仪中，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。

进一步地，所述步骤(2)中的水相中含有循环游离DNA模板、正反向引物、dNTPs、PCR缓冲液和DNA聚合酶。

进一步地，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶为高保真的Klenow Fragment、KAPA HiFi家族高保真DNA聚合酶、Phusion家族高保真DNA聚合酶、Q5家族高保真DNA聚合酶中的任一种。

进一步地，所述水相DNA模板总量1-10ng、正反向引物终浓度为0.1-1μM、dNTPs终浓度为0.5-2mM、PCR缓冲液终浓度为1倍、DNA聚合酶终浓度为0.1-1U。

进一步地，所述步骤(2)中所述探针序列与所述循环肿瘤DNA特异性结合以后，通过链霉亲和素磁珠特异性结合生物素而捕获所述循环肿瘤DNA。