[发明专利]一种MLH融合抗菌肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种MLH融合抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的MLH融合抗菌肽，其特征在于，编码所述MLH融合抗菌肽的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种制备如权利要求1或2所述MLH融合抗菌肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽为母体肽，设计杂合基因MLH的编码基因片段；

S2、将步骤S1的编码基因片段与表达载体pET-32a连接，构建重组表达载体pET-32a-MLH；

S3、将重组表达载体pET-32a-MLH转入宿主细胞E.coli BL21中，构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21；

S4、对重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21进行IPTG诱导蛋白融合表达，经亲和层析得到纯化的MLH融合抗菌肽。

4.根据权利要求3所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，步骤S1中，根据E.coli密码子的偏好性获得杂合抗菌肽MLH的编码基因，编码杂合基因MLH融合抗菌肽的基因碱基序列为：

CGGAATTCGGTTGGCTGAAAAAAATCGGTAAAAAAATCGAACGTGTTGGTCAGCACACCCGTAAACGTATCGTTCAGCGTATCAAAGCTAAAAAAGTTTTCAAACGTCTGGAAAAACTGTTCTCTAAAATCCAGAACCTCGAGCGG；

通过SOE-PCR进行全基因合成，设计三条引物，使PCR产物形成重叠链，所述三条引物分别为：seq1如序列表中SEQ ID NO.3所示；Seq2如序列表中SEQ ID NO.4所示；Seq3如序列表中SEQ ID NO.5所示，在seq1和Seq3的5’端加入EcoR I酶切位点，3’端加入Xho I酶切位点和保护碱基共146bp。

5.根据权利要求4所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，根据所述杂合抗菌肽MLH的编码基因片段序列设计上游引物p1如序列表中SEQ ID NO.6所示，上游引物p1：5’-CGGAATTCGGTTGGCTGAAAAAAAT-3’；下游引物p2如序列表中SEQ ID NO.7所示，下游引物p2：5’-CCGCTCGAGGTTCTGGATTTTAGAGA-3’；以所述PCR产物为模板进行PCR扩增，并将PCR产物进行切胶回收。

6.根据权利要求5所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，回收目的片段与表达载体pET-32a骨架，在Solution I体系中进行过夜连接，采用CaCl2法制备感受态E.coli DH5α细胞，将过夜产物导入到感受态细胞中，构建重组表达载体pET-32a-MLH。

7.根据权利要求3所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，步骤S4中，采用LB培养基，37℃摇床过夜培养至OD600达到0.6～0.8加入1.0mM的IPTG、37℃诱导表达3.5h。

8.根据权利要求7所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，将步骤S4诱导表达的菌液在360W超声0.5s，停2s，15min超声破碎细胞；4℃，12000rpm，离心15min，收集上清液；其中，按每100mg菌体加入2mL细菌裂解液，20μL蛋白酶抑制剂混合物充分混匀并悬浮离心收集的菌体。

9.根据权利要求8所述的一种MLH融合抗菌肽制备方法，其特征在于，对收集的上清液进行Ni²⁺离子亲和层析纯化，获得纯度大于90％的MLH融合抗菌肽，透析除盐和超滤管浓缩后备用。