[发明专利]一种MLH融合抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种MLH融合抗菌肽及其制备方法和应用，以家蝇抗菌肽、LL‑37和幽门螺杆菌肽为母体肽，利用生物信息学方法分析获得MLH的氨基酸序列，并根据E.coli密码子偏好性编码杂合基因MLH的基因片段。采用SOE‑PCR技术合成所需的目的基因，并将其与表达载体pET‑32a(+)连接，转化至大肠杆菌表达菌株构建重组基因工程菌pET‑32a‑MLH/BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白融合表达，最后对获得的融合表达的杂合肽进行抑菌活性鉴定，结果表明，融合表达的杂合肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种MLH融合抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

近些年来，抗生素滥用现象日益严重，越来越多的细菌发展成对传统抗生素耐药性菌株。抗菌肽因其稳定的理化性质、广谱的抗菌性以及对靶菌株不易产生耐药性等特点成为抗生素的理想替代品，受到了广泛的关注。抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽类物质，是机体先天性免疫的重要组成部分。具有与抗生素不同的靶点和作用机制，对抗生素耐药菌也有很好的抑菌效果，具有广谱的抗菌性，对G⁺、G^-菌以及真菌等均有一定的抑制作用。

目前抗菌肽的获得主要有三种途径：从生物体中直接分离提取；化学方法直接合成；运用基因工程方法获得。由于抗菌肽在生物中的含量较低，直接提取难度较大且费用较高，难以实现大量生产；化学合成法也因成本高而很少用于规模化生产。近些年来，基因工程技术的快速发展，使规模化生产抗菌肽成为可能，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种MLH融合抗菌肽及其制备方法和应用，生产抗生素替代品，在医药卫生、畜牧养殖、食品加工以及农业等领域拥有广阔的应用前景。

本发明采用以下技术方案：

一种MLH融合抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，编码所述MLH融合抗菌肽的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

一种MLH融合抗菌肽制备方法，包括以下步骤：

S1、以家蝇抗菌肽、LL-37和幽门螺杆菌肽为母体肽，设计杂合基因MLH的编码基因片段；

S2、将步骤S1的编码基因片段与表达载体pET-32a连接，构建重组表达载体pET-32a-MLH；

S3、将重组表达载体pET-32a-MLH转入宿主细胞E.coli BL21中，构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21；

S4、对重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21进行IPTG诱导蛋白融合表达，经亲和层析得到纯化的MLH融合抗菌肽。

优选的，步骤S1中，根据E.coli密码子的偏好性获得杂合抗菌肽MLH的编码基因，通过SOE-PCR进行全基因合成，设计三条引物，使PCR产物形成重叠链，所述三条引物分别为：seq1如序列表中SEQ ID NO.3所示；Seq2如序列表中SEQ ID NO.4所示；Seq3如序列表中SEQ ID NO.5所示，在seq1和Seq3的5’端加入EcoR I酶切位点，3’端加入Xho I酶切位点和保护碱基共146bp。

优选的，根据所述杂合抗菌肽MLH的编码基因片段序列设计上游引物p1如序列表中SEQ ID NO.6所示，下游引物p2如序列表中SEQ ID NO.7所示，以所述PCR产物为模板进行PCR扩增，并将PCR产物进行切胶回收。

优选的，回收目的片段与表达载体pET-32a骨架，在Solution I体系中进行过夜连接，采用CaCl2法制备感受态E.coli DH5α细胞，将过夜产物导入到感受态细胞中，构建重组表达载体pET-32a-MLH。