[发明专利]一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域。

背景技术

近年来，我国每年由于外伤、感染及肿瘤等原因造成机体骨缺损或骨损伤的患者达数百万例。自体骨移植不但给患者造成额外的身体创伤，同时给患者带来严重的心理和生理负担，而异体骨虽然可成为临床上自体骨移植的替代材料，但由于供体有限，难以大幅应用，同时异体骨移植还存在免疫排斥反应、并可能存在传染疾病的风险等问题，因而也难以成为骨病治疗的理想策略。随着骨组织工程和再生医学的发展，将成骨细胞与生物支架结合，通过体外培养、构建成复合材料后移植到骨损伤部位，随着生物支架的不断降解和吸收，成骨细胞不断增殖并分泌细胞因子和基质，从而实现对骨损伤部位的治疗和修复（Vacanti CA, et al., Plast Reconstr Surg, 1991, 88(5): 753-759; Cao Y, et al., Transplant Proc, 1994, 26(6): 3390-3392）。

在骨组织工程中，获得较为理想的种子细胞是实现骨损伤有效治疗和修复的最基本和最核心的要素之一。目前认为，理想种子细胞应当具备以下基本条件：（1）取材方便，对机体损伤小；（2）体内、外生长和增殖能力较强，能在较短时间内获得足够数量的细胞；（3）体外、内的成骨能力较强；（4）具有稳定的生物学功能，成骨后能够稳定保持与正常骨细胞相似的生物学特性并维持一定时间；（5）良好的材料和组织相容性，能够在支架材料上大量增殖，在体内环境能保持良好的生物学特性。当前，种子细胞的来源主要有成骨细胞、骨髓基质细胞、基因修饰细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等。

成骨细胞是骨组织工程中使用的比较经典的种子细胞类型，通常来源于骨组织或骨膜，其在体外和体内均具有较强的成骨能力（Vacanti CA, et al., Transplant Proc, 1993, 25: 1019-1021; Castoldi M, et al., Cell Biol Int, 1997, 21(1):7-16），其培养条件也相对简单，细胞易存活（Hankey DP, et al., Acta Orthop Scand, 2001, 72(4): 395-403）。但是成骨细胞取材会对供体造成损伤，在临床上难以广泛应用，此外成骨细胞易于衰老，这也限制了成骨细胞在临床上的应用。

骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）是一种可形成类骨和类软骨物质的细胞类型（王萍，等，中国临床康复，2006,10(41):130-132）。由于BMSCs相对容易获得，体外培养较为容易，从成体骨髓中分离的BMSCs仍保持分化潜能，可用来修复骨骼肌组织损伤和大块骨缺损（Bianco P, et al., Stem Cells, 2001, 19(3):180-192; Quarto R, et al., N Engl J Med, 2001, 344(5): 385-386）。但是，BMSCs是多个细胞类群的集合，具有不确定的分化特征，此外，随着培养时间的延长，BMSCs易于失去增殖潜能、降低生长速率、细胞形态发生改变、端粒变短以及细胞衰老等问题（Banfi A, et al., Tissue Eng, 2002, 8(6): 901-910），同时BMSCs体外培养的条件要求较高，培养条件的改变会严重影响BMSCs的分化潜能。

基因修饰细胞是指利用基因工程技术将种子细胞进行基因修饰，以实现种子细胞特定的功能能力，研究表明，经过基因修饰的骨髓基质细胞、间充质干细胞均能够较好向成骨细胞分化，参与新骨的生成（Marie PJ, et al., Histol Histopathol, 2002, 17(3): 877-885; Cheng SL, et al., Calcif Tissue Int, 2001, 68(2): 87-94）。但是，目前基因修饰细胞大多需要病毒载体介导才能产生，这势必为临床应用带来安全隐患，同时获取基因修饰细胞需要较高的技术和条件，这些因素都限制了基因修饰细胞的研究和应用。