[发明专利]一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法

权利要求书

1.一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒，包括：漂洗液、裂解液、抽提液A、抽提液B、结合缓冲液、过柱缓冲液、洗脱缓冲液和吸附柱，其特征在于：还包括助研剂，所述助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸；所述漂洗液中包含Tris-HCl、EDTA-Na₂、NaCl、KAc、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和聚乙二醇；所述裂解液中包含CTAB、Tris-HCl、EDTA-Na₂、NaCl、山梨醇、硼砂、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和蛋白酶K。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述助研剂中不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸的质量份数比为：5-20：5-20：1-10。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/L EDTA-Na₂，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/L KAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na₂，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇，0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶K的酶活为≥30U/mg。

6.一种常绿木本植物基因组DNA的提取方法，包括取样、研磨、裂解、抽提、结合、过柱、洗柱、晾干和洗脱步骤，其特征在于：研磨过程中加入助研剂，助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸，每5-10质量份数的样品中加入5-20质量份不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、5-20质量份石英砂和1-10质量份抗坏血酸；在裂解前增加漂洗步骤，该步骤是向样品中加入漂洗液，震荡混匀后置于冰上处理，离心后去上清；其中，所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/L EDTA-Na₂，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/LKAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇；在裂解步骤中加入的裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na₂，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇，0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K；

所述的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、取样：取新鲜健康无虫害叶片，低温或加入变色硅胶保存；

步骤二、研磨：清洗叶片，去叶柄和叶脉，剪碎后置于液氮中进行研磨，研磨过程中加入助研剂，研磨完成得样品粉末；其中，每50-100mg剪碎后叶片研磨过程中加入的助研剂包含0.05-0.2g不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、0.05-0.2g石英砂和0.01-0.1g抗坏血酸；

步骤三、漂洗：取60mg样品粉末置于2mL离心管中，加入1mL漂洗液，震荡混匀后于冰上处理5min，8,000rpm离心5min，弃上清；重复本步骤1~2次；其中，漂洗液在使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；

步骤四、裂解：加入1mg活性炭粉末和600μL 经65℃预热的裂解液，混匀，封闭离心管管口，65℃水浴处理30min，之后将离心管取出置于冰上冷却至室温；其中，裂解液在使用前加入β-巯基乙醇，使裂解液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；

步骤五、抽提：加入与离心管中溶液等体积的抽提液A，颠倒混匀，于室温条件下≥12000rpm离心5min，将上清液转移到另一干净的离心管中；向该离心管中加入与上清液等体积的抽提液B进行再次抽提，于室温条件下≥12000rpm离心5min，吸取上清液，重复此步骤至看不到界面上有环状白色沉淀为止；其中，所述抽提液A为体积比为25：24的酚和氯仿的混合液，抽提液B为体积比为24：1的氯仿和异戊醇的混合液；

步骤六、结合：向离心管中加入其内溶液1.5倍体积的结合缓冲液，颠倒混匀，静置，溶液中产生絮状沉淀；所述结合缓冲液中包含4-6mol/L盐酸胍，0.05-0.1mol/L Tris-HCl和0.01-0.05mol/L EDTA-Na₂，pH=5-6；

步骤七、过柱：将步骤六的絮状沉淀随溶液一同转移至DNA吸附柱，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

步骤八、去色素：向吸附柱中加入500~700μL无水乙醇，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

步骤九、洗柱：向吸附柱中加入500~700μL 的过柱缓冲液；所述过柱缓冲液为体积分数为70%~85%的乙醇；于≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复此步骤一次；

步骤十、晾干：晾干吸附柱中吸附材料上残余的乙醇；

步骤十一、洗脱：向吸附柱吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL经预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，≥12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；其中，洗脱缓冲液中包含0.01mol/L Tris-HCl和0.001-0.01mol/L EDTA-Na₂，pH=8.0-8.5；

步骤十二、检测、保存。