[发明专利]肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型及其构建方法和构建系统

权利要求书

1.一种肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

选取若干份相异人体的已经离体的肾移植术后急性排斥反应受者的外周血标本；

从外周血标本中分离T淋巴细胞；

提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液；

以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库；

采用高通量测序技术，对所述CDR3基因文库进行测序；

对测序结果进行分析，构建肾移植术后急性排斥反应受者T细胞抗原受体图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液之后，以及在以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库之前，所述构建方法还包括：

测定DNA提取液中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA提取液的完整性。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，测定所述DNA待测液的完整性包括如下步骤：

将DNA提取液与加样缓冲液混合后加入孔板通电进行电泳，在电压为150V的条件下电泳40分钟；

取出凝胶，并在紫外灯下检查。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，从外周血标本中分离T淋巴细胞，具体为：

选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞，得到单个核细胞；

选用免疫磁珠间接法从单个核细胞悬浮液中分离T淋巴细胞。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，提取T淋巴细胞中的DNA，得到DNA提取液，具体为：

取5000μL单个核细胞悬浮液放入10ml离心管中；

加入20mg/ml蛋白酶K 25微升，22℃～26℃条件下保存20分钟，中间颠倒离心管数次使其混合均匀，用200μL结合液CB加入到离心管中，马上颠倒数次使其充分混匀，于70℃～75℃水浴放置15分钟；

加入100μL异丙醇，充分混匀，得到混合液；

把混合液置于吸附柱当中，再使吸附柱置入收集管中，10000rpm离心0.5分钟，去除废液；

加入4500μL抑制物去除液，12000rpm高速离心0.5分钟，舍弃废液；

加入漂洗液700μL，再次12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；

再次加入漂洗液500μL，继续使用12000rpm离心0.5分钟，舍弃废液；

再次使吸附柱重新置入收集管中，13000rpm离心120秒，舍弃废液；

把吸附柱置入另一离心管中，加入100μL提前预热洗脱缓冲液，26℃条件下放置4分钟，再次使用12000rpm离心60秒；将得到的溶液重新加入吸附柱中，26℃条件下放置120秒后使用12000rpm离心60秒；

收集T细胞DNA并在2℃～8℃中保存。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以DNA提取液中的DNA为模版，扩增出TCR的CDR3区，得到CDR3基因文库，具体为：

取DNA提取液中的DNA；

加入引物；

进行多重PCR；

电泳检测回收120bp～200bp的多重PCR产物，得到第一样本；

取所述第一样本进行末端修复反应，纯化得到第二样本；

取3’末端具有T碱基的接头与所述第二样本连接，得到第三样本；

将所述第三样本进行多重PCR反应扩增，电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到所述CDR3基因文库。