[发明专利]一种经人参提取物FQR1诱导的DC‑CIK细胞的冻存方法

权利要求书

1.一种经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞的冻存方法，其特征在于，将经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞悬液与冻存液混合，采用程控降温仪降温后置于液氮中保存，

其中，程控降温仪的参数为：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h。

2.权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，冻存液的配制：淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜，其配比是9:1。

3.权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，在液氮中保存时间为180天。

4.权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，淋巴细胞无血清培养基的名称为Medium CTS^TM#087-0112DK，购置于美国Gibco公司。

5.权利要求1所述的冻存方法，应用于DC-CIK细胞的保存。

6.权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

人参提取物FQR1的制备：

取生晒参500g，高速组织捣碎机粉碎，加入10倍量10mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液充分搅拌后，4℃搅拌浸提12h。6000rpm离心30min，收集上清液。向沉淀中再次加入10倍量的10mM pH7.4的Tris-HCl进行二次浸提，离心后收集上清液，合并两次的上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为80％，搅拌均匀后4℃静置过夜离心，沉淀用蒸馏水洗涤3次后冻干。将冻干样品放入透析袋中，4℃透析过夜后冻干，冻干品即为人参提取物FQR1，

FQR1诱导的DC-CIK细胞的培养：

细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加到淋巴细胞分离液表面，2500rpm离心20min；用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，室温1500rpm离心沉淀10min，弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心7min，弃上清；细胞沉淀物用RPMI1640培养液调整细胞密度为(4～6)×10⁶个/ml，置于37℃、5％CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2小时；收集非贴壁细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为(1～2)×10⁶个/ml，进行体外诱导，在含浓度为10ug/ml的人参提取物FQR1、1000U/ml rhIFN-γ的完全培养基中悬浮培养24小时后，加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml，继续培养，以后隔天更换新鲜培养液一次，补充rhIL-2，细胞密度维持在(1～2)×10⁶个/ml；将贴壁细胞接种于6孔培养板，加入含rhIL-4500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、FQR1 10ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，隔日半量换液，适时补充培养基及细胞因子；在培养第6天，加入终浓度为100ng/ml的rhTNF-α；分别收获CIK、CD细胞，计数后1:5的比例混合后，体外培养5天，获得DC-CIK细胞，

冻存液的制备方法：

在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆和二甲基亚砜，使自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％。

DC-CIK细胞分组冻存：

冻存液悬浮DC-CIK细胞，得到1×10⁷个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液，将上步所得到的冻存管，放入程控降温仪的冻存盒中进行冻存，随后取出冻存管迅速放置于液氮中，程控降温仪的设定参数是：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h。