[发明专利]一种经人参提取物FQR1诱导的DC‑CIK细胞的冻存方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及FQR1诱导的DC-CIK细胞的冻存方法。

背景技术

随着经济的快速发展，人类赖以生存的环境承受着巨大压力。近年来，环境问题日益严重，伴随着肿瘤患者如井喷之势急剧增加，因此，如何治疗肿瘤疾病并提升肿瘤患者的幸福指数已成为社会各界研究的重点。

肿瘤细胞的生物治疗是除化学治疗、放射治疗和手术治疗以外新兴、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自体免疫细胞抗癌的新型治疗方法。

DC-CIK细胞是自体DC细胞和CIK细胞共同培养后生成的异质细胞群。通过申请号为201510708335.3的发明专利，我们可以看出经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞可进一步提高DC-CIK细胞的杀瘤活性。但是，DC-CIK细胞的不足之处在于，制作成本高、制作周期长和冻存后细胞活性降低等，严重影响其使用范围。

现有的冷存方法主要包括两种，第一种方法是将含有目的细胞悬液的冻存管，放置入程序冻存盒，-70℃放置12小时后转入液氮中保存；第二种方法是将含目的细胞悬液的冻存管-20℃放置2小时后，转入-70℃放置12小时，最后将其转入液氮中保存。但现有的冷存方法，存有冻存时间长、复苏后细胞活性低等缺陷。

为此，亟待研发出一种经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞的冻存方法，提高复苏后的细胞活性，具有重大的现实意义。

发明内容

本发明目的是提供一种经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞的冻存方法。

本发明的冷冻方法为：将经人参提取物FQR1诱导的DC-CIK细胞悬液与冻存液混合，采用程控降温仪降温后置于液氮中保存。

其中，程控降温仪参数是：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h；在液氮中保存的时间是180天。

其中，冻存液的配制：淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜，其配比是9:1(V/V)。

其中，淋巴细胞无血清培养基，具体名称为 CTSTM#087-0112DK，购置于美国Gibco公司。

本发明的的冻存方法作为DC-CIK细胞的保存中的应用。

本发明与用常规冻存的DC-CIK细胞相比，本发明的冻存方法具有冻存时间短、复苏时间短和复苏后细胞活性高等优点，会极大的增加DC-CIK细胞的应用范围，具有很重要的现实意义。同时，本发明冷存过程，操作简单，容易控制，不仅有效的节约时间，而且大大降低成本。

本发明的冻存方法，可长效高活性保存DC-CIK细胞180天。利用本发明公开的冻存流程冻存DC-CIK细胞，复苏后的细胞存活率达98％以上，且保持优异的增值率和杀伤活性。

附图说明

图1为实施例中冻存前和冻存后DC-CIK细胞的细胞增殖曲线

图2为实施例中冻存前和复苏后DC-CIK细胞的细胞毒性比较

具体实施方式

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》人参提取物FQR1的制备

取生晒参500g，高速组织捣碎机粉碎，加入10倍量10mM pH 7.4的Tris-HCl(0.15M NaCl)缓冲液充分搅拌后，4℃搅拌浸提12h。6000rpm离心30min，收集上清液。向沉淀中再次加入10倍量的10mM pH7.4的Tris-HCl(0.15M NaCl)进行二次浸提，离心后收集上清液，合并两次的上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为80％，搅拌均匀后4℃静置过夜离心，沉淀用蒸馏水洗涤3次后冻干。将冻干样品放入透析袋中，4℃透析过夜后冻干。冻干品即为人参提取物FQR1。

《实施例2》DC-CIK细胞的制备

患者准备：根据免疫细胞DC-CIK治疗的适应症和禁忌症，选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合；

签署知情同意书；检测血常规；

外周血动员：采血前24小时皮下注射GM-CSF 150ug；

外周血采集：病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；