[发明专利]表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体

权利要求书

1.一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-M2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；

(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-M2表达载体上，构建出M+Blunt-M2质粒；

(3)以M+Blunt-M2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-M2基因片段；

(4)采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-M2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans 1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-M2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：所述PEDV为变异猪流行性腹泻病毒。

3.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述特异性引物序列如下：

a、M

M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCC

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

b、M2+M

M2+M-F:AAGGGCGATCCGGAACAA

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

c、N

N-F:AGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCG

N-R:TTGTTCCGGATCGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTG。

4.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：步骤(2)在构建M+Blunt-M2质粒时，pEASY-Blunt-M2表达载体与M基因片段的摩尔浓度比为1:7，反应时间按连接片段大小进行，片段长度在0.1-1kb时，反应时间在5-10分钟，片段长度在1-2kb时反应时间在10-15分钟，片段长度在2-3kb时反应时间在15-20分钟，大于3kb时反应时间在20-30分钟。

5.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：在步骤(3)得到的回收产物中加入DMT酶，降解模板。

6.如权利要求1-5任一项所述制备方法制备的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。

7.一种利用权利要求6所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体转染的重组工程细胞。

8.根据权利要求7所述的重组工程细胞，其特征在于：所述工程细胞为293T细胞。

9.一种表达PEDV的M+N双基因融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述方法包括：培养如权利要求7或8所述的重组工程细胞，并提取融合蛋白。