[发明专利]表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪群呕吐、腹泻、脱水及死亡为特征的消化道病毒性疾病。该病于1971年首次在英国报道，我国在1984年证实该病在的存在。自2010年下半年以来，由于传统的PEDV在基因上发生了缺失、插入及变异，导致该病对猪群的致病性增强，造成了大量的猪群发病死亡，损失惨重。目前世界上大多数养猪国家都有发生变异PEDV的报道，尤其以中国、韩国、日本、泰国和美国等国家发病严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，并已成为影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。PEDV的基因组长大约在28000bp左右，主要含有4个结构蛋白，分别为S、M、N及E蛋白。目前，已见通过PEDV的单个基因如N、S及M基因段片，通过原核表达方法表达出单基因蛋白，但未见通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt-M2哺乳动物真核表达载体，通过无缝拼接技术，构建出表达PEDV的M+N的双基因真核表达载体。因此，一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的方法的建立，对今后开展该病或其他病原的诊断技术及基因工程疫苗的研究，具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，以及由该制备方法制备的载体。

本发明的另一个目的是提供转染了真核表达载体的重组工程细胞。

本发明的再一个目的是提供使用了真核表达载体的融合蛋白的制备方法。

本发明是这样实现的：

本发明首先提供了一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-M2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；

(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-M2表达载体上，构建出M+Blunt-M2质粒；

(3)以M+Blunt-M2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-M2基因片段；

(4)采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-M2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans 1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-M2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。

所述PEDV优选变异猪流行性腹泻病毒。

其中步骤(1)所述特异性引物序列如下：

a、M

M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCC

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

b、M2+M

M2+M-F:AAGGGCGATCCGGAACAA

M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT

c、N

N-F:AGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCG

N-R:TTGTTCCGGATCGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTG。

其中步骤(2)在构建M+Blunt-M2质粒时，pEASY-Blunt-M2表达载体与M基因片段的摩尔浓度比为1:7，反应时间按连接片段大小进行，片段长度在0.1-1kb时，反应时间在5-10分钟，片段长度在1-2kb时反应时间在10-15分钟，片段长度在2-3kb时反应时间在15-20分钟，大于3kb时反应时间在20-30分钟。

优选地，在步骤(3)得到的回收产物中加入DMT酶，降解模板。

其次，本发明提供了由所述制备方法制备的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。

另外，本发明还提供了利用所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体转染的重组工程细胞。

优选地，所述工程细胞为293T细胞。

最后，本发明还提供了一种表达PEDV的M+N双基因融合蛋白的制备方法，所述方法包括：培养所述的重组工程细胞，并提取融合蛋白。