[发明专利]兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法

权利要求书

1.一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ ID No：21、SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所示。

2.权利要求1所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其步骤如下：

1)、载体的构建：根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15或SEQ ID No：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

目的基因序列是将氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ ID No：21或SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25、SEQ ID No：26所示的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中硒代半胱氨酸的编码序列替换为琥珀型终止密码子TAG后的基因，在生物公司用DNA合成仪人工合成该目的基因序列对应的编码基因，确保两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得到高活力兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。