[发明专利]兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的双功能抗氧化酶及其制备方法。

背景技术

活性氧(ROS)是机体氧代谢的副产物，正常生理状态下，ROS的产生和消除处于动态平衡状态，从而维持机体氧化和抗氧化的相对平衡。然而，随着生态恶化、环境污染及现代化生活不规律的程度日趋加深，多种内在及外在因素导致ROS的过量产生，当过多的ROS不能及时清除，与之相伴的疾病也愈加严重和高发，对人类的健康造成严重威胁。

机体针对活性氧的酶学防御系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内多种活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)，而且来源有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。SOD是超氧阴离子(O₂^·-)的唯一清除剂，能转化O₂^·-为过氧化氢(H₂O₂)，继而被CAT、GPX等将其分解为水(H₂O)，从而使有害的O₂^·-和H₂O₂转化为无害的水分子。如果抗氧化酶的协同作用被破坏，可将ROS的损伤效应放大，从而引发多种疾病。根据这些酶在清除ROS时的协同作用，获得兼具GPX和SOD两种抗氧化功能于一体的双功能抗氧化酶，相比单一抗氧化酶，更有利于清除活性氧，发挥其巨大的应用价值。

中国专利201110287018.0公开的方法是制备一种兼具SOD和GPX活性的65肽，是将SOD和GPX活性中心的结构域整合而形成的小分子双功能模拟酶，正象其说明书中显示的那样，其GPX活力831U/umol远低于天然GPX 57801U/umol的活力。中国专利201310302778.3、201310142866.1和201510431360.1公开的方法在活力上取得了突破性进展，但其只能用于制备高活力的各型单功能GPX及其突变体，不包括双功能抗氧化酶及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的氨基酸序列并用中国专利201510431360.1公开的人工合成的能通读UAG为硒代半胱氨酸的杂合tRNA和特殊的工程菌制备该双功能抗氧化酶。本发明涉及序列SEQ ID No:1～26，其由GPX和SOD两种酶的氨基酸序列组成，既能分解SOD的底物，又能分解GPX的底物。先用基因合成法获得杂合tRNA基因，再合成或扩增GPX和SOD基因，将两者组装到同一个能够表达杂合tRNA的分泌型原核表达载体上，转化TAG工程菌，在亚硒酸钠存在下诱导表达，通过常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团Sec引入到蛋白的底物结合部位，赋予其高的GPX和SOD活性。本发明方法简单，酶蛋白活力和产量高、稳定性好，具有高效的抗氧化功能。

本发明应用基因工程技术、原核细胞培养技术，以基因组中所有UAG终止密码子被UAA终止密码子替代及删除释放因子RF 1的大肠杆菌为表达系统，利用人工合成的杂合tRNA编码UAG终止密码子为硒代半胱氨酸(硒代半胱氨酸)，从而通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性中心定点插入和高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的高效表达。本方法可以在避开原核生物编码硒代半胱氨酸的复杂机制及低效率等缺点，发挥原核生物便于基因操作、高效表达外源基因和培养成本低等优点，为兼具GPX和SOD活性的双功能酶等具有药用价值的硒蛋白提供简单、高效的制备方法。本发明方法在日化品生产和生物制药方面具有广阔的应用前景。