[发明专利]一种蚯蚓中止咳祛痰抗炎抗微生物提取物的制备方法

说明书

本发明提供了一种蚯蚓中止咳祛痰抗炎抗微生物提取物的制备方法。本发明提供的提取方法主要是通过pH4.8‑5.4的NaAC缓冲液和丙酮对蚯蚓匀浆进行提取的。本发明经过反复试验，对本发明申请人之前提供的提取工艺进行了优化，大大缩短了蚯蚓提取物的制备时间，从42‑45小时缩短到了15—18个小时；并且得率从73％提高到了82％，提高了总活性的回收率，比活力从1141提高到了4443，比活力提高了3.9倍；纯化倍数从41倍提高到158倍，脱氧核糖核酸酶活性成分的纯化倍数增加近四倍。本发明提供的制备方法工艺简单、成本低、易于工业化生产推广应用。由本发明提供的制备方法制备得到的产品纯度和活性均要显著高于现有方法制备得到的相关类似产品。

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种地龙生物祛痰抗炎提取物及其制备方法。

背景技术

蚯蚓俗称地龙，是我国传统中药材，其体内含有多种生物活性成分，具有平肝息风、清热止痉、通络、平喘、利尿的功效，在一些哮喘性疾病中常被用到。研究表明它具有降压、抗血栓、平喘、解热镇痛、抗凝、抗菌、等生物学活性免疫调节等作用。其体内存在有止咳、化痰作用的活性成分；醇提取物具有抗炎作用。申请人对蚯蚓提取物的止咳、祛痰、抗微生物、抗炎作用及其制备方法进行了研究报道，在前期报道中(见文献Zhu Z,Yang Q,Yu B,et al. Purification and characterization of a novel earthworm DNase.PrepBiochem Biotechnol.2015； 45(4):365-79.)，蚯蚓提取物的制备方法操作比较耗时耗力，工艺冗长繁杂，得到的产物中仍然含有大量的杂质，分离效果不明显。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取物，所述提取物的制备方法包括：将pH4.8-5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。

具体的，所述pH4.8-5.4的缓冲液包括醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；所述醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液中的离子浓度包括0.1M；

再具体的，所述醋酸钠缓冲液包括0.1M NaAC缓冲液；所述0.1M NaAC缓冲液的溶质包括醋酸和醋酸钠，溶剂包括水，所述醋酸的浓度为0.1M、醋酸钠的浓度为0.1M；

所述蚯蚓匀浆具体包括将蚯蚓制成匀浆；具体的，在所述制成匀浆前，还包括将蚯蚓用水洗净；所述水包括蒸馏水；所述蚯蚓包括鲜活蚯蚓；所述制成匀浆还包括在4℃下制成匀浆；

具体的，所述pH4.8-5.4的缓冲液加入的体积包括等体积加入。

具体的，所述提取包括提取2小时。

具体的，所述提取后，还包括：

1)再加入丙酮后，放置1小时，离心；

所述加入的丙酮包括使丙酮的体积百分含量为15％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；

所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；

2)向步骤1)离心后所得上清中补加丙酮，放置2小时，离心；

所述补加丙酮包括使丙酮的体积百分含量为50％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；

所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；

3)向步骤2)离心后所得沉淀加水溶解；

所述水包括蒸馏水；所述溶解包括超声助溶；

4)再加入pH8.0Tris-HCl缓冲液，使所述Tris-HCl缓冲液终浓度为0.05M，放置2小时，离心；

所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心10分钟；