[发明专利]一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明是将嗜酸热硫矿硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶表面疏水区域相关的氨基酸残基进行取代。所得突变体实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶可溶性表达量不同程度的提高，突变体M106K、M106H麦芽寡糖基海藻糖合成酶可溶性表达量分别提高了145.32％、92.38％。突变体可溶性表达的提高利于其工业化应用。

技术领域

本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连结而成，是一种稳定的非还原性二糖，它有3种光学异构体，即αα型、αβ型和ββ型。

海藻糖是一种安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。

酶法转化生产海藻糖是上世界90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方法生产海藻糖的转化率高达80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶是双酶法生产海藻糖的其中一种酶。淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,4-糖苷键到α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，转化率高达80％以上，具有低成本的优点，但是麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因在宿主菌中的可溶性表达很低，产生较多的包涵体，酶活力低，不利于其工业化应用。因此，本发明利用基因工程和酶工程手段，在不影响麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶学性质和转化率的基础上提高其可溶性表达，从而提高酶活，为其工业化生产创造条件。

发明内容

本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，该突变体是通过将Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的蛋白表面疏水区域相关氨基酸残基进行取代后得到的。与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，突变体在宿主菌中的可溶性表达有一定程度的提高，宿主菌胞内麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活提高。

所述Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸(Leu)突变为苏氨酸(Thr)，突变体命名为L96T。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第96位亮氨酸(Leu)突变为组氨酸(His)，突变体命名为L96H。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸(Met)突变为赖氨酸(Lys)，突变体命名为M106K。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第106位甲硫氨酸(Met)突变为组氨酸(His)，突变体命名为M106H。