[发明专利]一种多功能载体的构建及使用方法

说明书

本发明公开了一种多功能载体的构建及使用方法。该多功能载体含有DNA片段A(自5’端到3’端依次含attL1、IIs型限制性内切酶A的识别序列、筛选标签序列1、所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、attL2)和DNA片段B(自5’端到3’端依次含T‑DNA右边界序列、ColE ori序列、筛选标签序列2、pSa ori序列、T‑DNA左边界序列)。该多功能载体采用Golden Gate法可将单个或多个片段“无逢”插入载体中，操作简单经济；由于载体尺寸小，既可通过农杆菌稳定转化植株，也可瞬时转化原生质；由于含attL序列，因此可将其作为入门载体把重组片段通过LR反应穿梭至目的载体，应用灵巧便捷。

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学领域，涉及一种多功能载体的构建及使用方法，具体涉及兼具植物双元目的载体和Gateway入门载体特征的pSPE的构建方法及其应用。

背景技术

近年来随着基因测序技术的快速发展，许多植物基因组测序已经完成，这为进一步的基因功能研究提供了巨大的便利和基础。基因功能的研究离不开基因DNA片段的克隆和植物基因的转化。便捷高效的植物转化载体在植物基因功能的研究中非常重要。

农杆菌介导的双元载体在植物转化中扮演着重要的角色。其中，基于pCambia骨架的系列载体是应用非常广泛的双元载体。它是根据Ti质粒改造的载体。野生型的Ti质粒中，既包括要转进植物的T-DNA片段，又包括基因转移所需的Vir基因等等，质粒非常大，有几百kb，不利于克隆构建等分子操作。在利用pCambia载体转化植物时，将vir基因等基因转移所需要的不用改变的部分放在一个大质粒上，转到农杆菌菌体里不用再动，而把T-DNA部分构件到pCambia骨架上。这样，需要进行克隆等分子操作的载体部分较小，大多pCambia骨架载体都在7-12kb左右。除此之外，pCambia载体在大肠杆菌中为高拷贝载体。并且在农杆菌中，其用pVS1复制子，非常稳定。在细菌中的筛选标记多为卡那霉素，在植物中的筛选标记有潮霉素，卡那霉素，除草剂等。pCambia骨架的系列载体既有利用传统酶切连接的方法构建的载体，也有经过Gateway方法兼容改造的载体。例如，pEarlygate系列载体和pMDC系列载体是应用比较广泛的Gateway兼容的pCambia骨架双元载体。

pGreen骨架载体是不同于pCambia载体的另一种植物转化双元载体。与pCambia载体相比，pGreen骨架载体更小，通常只有3-6kb左右。这是由于其将协助pGreen载体在农杆菌中复制的pSA起始子的辅助蛋白RepA等剥离出来，放到另一个辅助载体pSoup中。这样，剩下的T-DNA等必需元件更少，大大缩小了pGreen载体的大小。在转化农杆菌时，pGreen载体需要和pSoup一起转化农杆菌才能起作用。实际操作中可以首先将pSoup转化农杆菌制备成感受态，之后只需要转化进行分子构建的pGreen载体。小载体除了操作方便稳定，更重要的是其利于转化原生质体。这对许多在耗时的稳定转化之前，利用原生质体瞬时表达系统鉴定构建的正确性非常有帮助。

便捷高效的载体离不开简单方便的克隆构建方法。Golden Gate拼接，也叫IIS型克隆拼接法，是近年发展起来的一种利用IIS型限制性核酸内切酶介导的克隆拼接技术。IIS型限制性内切酶不同于普通的限制性内切酶，其识别位点和切割位点不相同。例如Bsa1，它首先特异性地识别双链DNA上的靶位点GGTCTC，然后在靶位点的下游一个碱基非特异性地切割DNA，产生4个碱基的黏性末端。在Golden Gate拼接操作中，用T4DNA连接酶将IIS型限制性内切酶酶切产生的两个或多个带有黏性末端DNA片段按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的DNA片段。在实际操作中，酶切和连接过程可在一个体系中同时进行，这样大大简化了步骤和提高了效率。此外，Golden Gate克隆拼接法获得的目的产物是“无缝”连接产物。因此，与传统的酶切连接方法相比，Golden Gate由于其经济，便捷，“无逢”使其成为一种理想的新型克隆方法和多片段拼接技术。