[发明专利]一种AsCpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种AsCpf1突变体蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1 所述AsCpf1突变体蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种含权利要求2或3所述的基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是以SEQ IDNO：2所示的AsCpf1（S589Q /P711T）为模板设计引物进行PCR扩增，再将纯化的PCR产物用无缝克隆方法插入pET15b载体的多克隆位点NcoI和XhoI之间得到。

6.一种权利要求1 所述AsCpf1突变体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①编码权利要求1 所述AsCpf1突变体蛋白原核表达载体的构建：以合成的核苷酸序列如SEQ ID NO：2 所示的AsCpf1（S589Q /P711T）基因为模板，用PCR的方法扩增编码AsCpf1突变体蛋白的基因片段，PCR扩增所用正向引物为：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTACACAGTTCGAGGGCTTTAC-3’（SEQ ID NO：6），

反向引物为：5’-TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAGTTAGTGATGATGATGATGATGG-3’（SEQ ID NO：7），

将得到的PCR产物进行纯化，用无缝克隆方法插入pET15b载体的多克隆位点NcoI和XhoI之间，得到重组表达载体，经测序验证阅读框及DNA序列全部正确，即成功构建了含AsCpf1（S589Q /P711T）基因的原核表达载体，命名为pET15b-AsCpf1（S589Q /P711T）；

②AsCpf1突变体蛋白的表达：将原核表达载体pET15b-AsCpf（S589Q /P711T）转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21（DE3），挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨苄青霉素的LB培养基，经37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导AsCpf1（S589Q /P711T）的表达；

③AsCpf1突变体蛋白的纯化：收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的Buffer A重悬，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过Ni-IDA柱；上样完毕用50ml Buffer E洗涤 Ni-IDA 柱；50ml Buffer G洗脱Ni-IDA 柱，分管收集；将洗脱到的目的蛋白过CM离子柱；100mlBuffer D洗涤CM离子柱；10ml Buffer B洗脱CM离子柱，分管收集；使用专业分析软件Grab-it 2.5 分析TAT-As-cpf1 蛋白纯度；洗脱的AsCpf1（S589Q /P711T）合并后将蛋白透析至20mM Tris，50mM NaCl，20% glycerol，pH7.5中；其中，Buffer A的组成为：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，1% Triton-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer E的组成为：20mM Tris-HCl，2MNaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer G的组成为：20mM Tris-HCl，50mMNaCl，0.1% TritonX-100，500mM咪唑，20% glycerol，pH7.5；Buffer D的组成为：20mMTris-HCl，50mM NaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer B的组成为：20mMTris-HCl，50mM NaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5。