[发明专利]一种AsCpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种AsCpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用。该AsCpf1突变体蛋白为序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；其编码基因是序列2所示的DNA分子；含有所述编码基因的重组表达载体是以序列2所示的AsCpf1(S589Q/P711T)为模板设计引物进行PCR扩增，再将纯化的PCR产物用无缝克隆方法插入pET15b载体的多克隆位点NcoI和XhoI之间得到；本发明的AsCpf1突变体蛋白及其编码基因、重组表达载体可用于基因编辑原代T细胞PD‑1。利用本发明的AsCpf1突变体蛋白能够实现原代T细胞PD‑1的敲降，为基因编辑T细胞PD‑1基因及癌症免疫治疗打下基础。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种AsCpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用。

背景技术

基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。CRISPR-Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

AsCpf1(Acidaminococcμs sp.Cpf1)是一种RNA介导的V型CRISPR-Cas9系统内切酶，在单链crRNA(CRISPR RNA)存在的情况下，AsCpf1识别双链DNA的5’-TTTN-3’PAM(protospacer adjacent motif)，并在双链DNA的与crRNA互补链的第18个碱基和非互补链的第23个碱基处对DNA进行切割。与CRISPR-Cas9基因编辑系统相比，CRISPR-AsCpf1系统具有不需要tracrRNA(trans-activating crRNA)、切割靶向DNA效率高、切割产生粘性末端等特点，是潜在的、可用于真核生物基因组编辑的工具。

PD-1(programmed death 1)，程序性死亡受体，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。作为癌症免疫治疗的重要靶点，以基因编辑T细胞的PD-1基因为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种AsCpf1突变体蛋白，可用于编辑T细胞的PD-1基因。

为实现上述目的，本发明提供的AsCpf1突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二是提供一种重组AsCpf1基因突变体，对AsCpf1基因进行结构改造，可用于编码上述AsCpf1突变体蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的一种重组AsCpf1基因突变体AsCpf1(S589Q/P711T)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。AsCpf1(S589Q/P711T)是对AsCpf1基因进行密码子优化，并将野生型AsCpf1中的两个氨基酸位点(S598Q和P711T)突变得到。

本发明的目的之三是提供一种含重组AsCpf1基因突变体的重组表达载体。

为实现上述目的，本发明提供的重组表达载体pET15b-AsCpf1(S589Q/P711T)，是以SEQ ID NO：2所示的AsCpf1(S589Q/P711T)为模板设计引物进行PCR扩增，再将纯化的PCR产物用无缝克隆方法插入pET15b载体的多克隆位点NcoI和XhoI之间得到。

本发明的目的之四是提供AsCpf1突变体蛋白的制备方法，得到高纯度的AsCpf1突变体蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的AsCpf1突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：