[发明专利]一种重组耐热木聚糖酶的制备方法

权利要求书

1.一种重组耐热木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对来源于嗜热细菌Thermotoga petrophila RKU的耐热木聚糖酶基因tx进行优化；优化后的耐热木聚糖酶基因tx序列如SEQ ID NO.1所示；

S2.合成步骤S1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，构建重组表达载体，将构建成功的重组表达载体转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选；

S3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，即得。

2.根据权利要求1所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，其特征在于，步骤S2中表达载体为pPICZαA或pPIC9K。

3.根据权利要求1所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，其特征在于，步骤S3高密度发酵步骤为：

I.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD₆₀₀＝5；

II.向发酵罐中加入20L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.0，加入4.35mL/L PTMl，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500～800rpm，溶氧维持在20％以上；

III.培养20～30h后，用氨水或磷酸调节pH值至4.5～7.0，培养温度为24～32℃，流加100％甲醇进行诱导培养，诱导培养144～192h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。

4.根据权利要求3所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，其特征在于，高密度发酵步骤II中，加入种子培养液16～24h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12mL/L PTM1的50％甘油，补料速度为18mL/L·h，持续补加4～6h。

5.根据权利要求3所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，其特征在于，高密度发酵步骤III中：培养20～30h后，用磷酸调节pH值至5.5，温度为26℃，流加100％甲醇进行诱导培养并补加PTMl，诱导培养168h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化，即得。