[发明专利]一种重组耐热木聚糖酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种重组耐热木聚糖酶的制备方法。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是自然界中第二大含量丰富的可再生资源。木聚糖酶能够将木聚糖水解为低聚木糖及木糖，根据木聚糖酶的作用方式可将木聚糖酶分为β-1,4-内切木聚糖酶，β-木糖苷酶，α-葡萄糖醛酸苷酶，α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶等。β-1,4-内切木聚糖酶能够水解木聚糖主链的β-1,4糖苷键，产生低聚木糖和少量木糖，是降解木聚糖的关键酶。由于β-1,4-内切木聚糖酶能够有效的水解木聚糖主链的β-1,4糖苷键，使其在饲料、造纸等工业领域具有巨大的应用潜力。目前限制β-1,4-内切木聚糖酶在饲料、造纸等工业领域产业化应用的主要因素是耐热性能差、生产成本高。饲料及造纸等工业领域均涉及到高温加工环节，普通的β-1,4-内切木聚糖酶经过高温环节后，酶容易变性失活，不能发挥作用。因此筛选及高效表达高温耐热β-1,4-内切木聚糖酶可以有效的推动β-1,4-内切木聚糖酶在饲料、造纸等工业领域的产业化应用。

中国专利申请(CN103602645A)公开了一种木聚糖酶的制备方法，木聚糖酶的制备方法，包括下述步骤：

活化菌种：用YPD培养基，对含有耐热木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为28～32℃，20～26h，所述的YPD培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于28～32℃下，以180～220r/min的转速进行扩大培养；二次扩大培养：22～26h后接入种子罐，28～32℃条件下进一步扩大培养；发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，28-32℃下，pH4.6～4.8条件下进行发酵，140～160h后发酵结束；过滤：将发酵结束的料液，加入1％的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力<0.5MPa；超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000Da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂，所述的防腐剂包括盐和山梨酸钾；盐的浓度为8-12％，山梨酸钾的浓度为1-3‰；加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。其发酵得到的木聚糖酶的酶活依旧需要提高。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种重组耐热木聚糖酶TX的制备方法。本发明通过密码子优化技术优化了来源于嗜热细菌Thermotoga petrophila RKU的β-1,4-内切木聚糖酶基因tx，将优化后的tx基因转入毕赤酵母得到了表达耐热β-1,4-内切木聚糖酶TX的重组工程菌。最后通过高密度发酵技术，实现了耐热木聚糖酶TX的高效表达，为其产业化应用奠定基础。

本发明通过以下技术方案实现：

一种重组耐热木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：

S1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对来源于嗜热细菌Thermotoga petrophila RKU耐热木聚糖酶基因tx进行优化，优化后的耐热木聚糖酶基因tx序列如SEQ ID NO.1；

S2.合成步骤S1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，构建重组表达载体，将构建成功的重组表达载体转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选；

S3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，即得。

优选地，步骤S2中表达载体为pPICZαA或pPIC9K。

优选地，步骤S3高密度发酵步骤为：

I.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD₆₀₀＝5；

II.向发酵罐中加入20L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH值至5.0，加入4.35mL/L PTMl，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm，溶氧维持在20％以上；

III.培养20～30h后，用氨水或磷酸调节pH值至4.5～7.0，培养温度为24～32℃，流加100％甲醇进行诱导培养，诱导培养144～192h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。

进一步地，高密度发酵步骤II中，加入种子培养液16～24h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12mL/L PTM1的50％甘油，补料速度为18mL/L·h，持续补加4～6h。