[发明专利]一种用于以实时荧光RT‑PCR检测样品中HIV‑1病毒的引物对和包含其的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及一种用于检测HIV-1病毒载量的引物序列，以及含有所述引物序列的试剂盒。

背景技术

人免疫缺陷病毒(又称艾滋病病毒，HIV病毒)是造成艾滋病的主要病原体，其属于逆转录病毒科慢病毒属(lentiviruses)中的灵长类慢病毒群(Weiss et al.,1993,Douek et al.,2009)，基因组为两条相同的正链RNA。常见的艾滋病病毒株有两种，即HIV-1和HIV-2两种类型。其中HIV-1型起源于中非，以后扩散到地中海地区、欧美地区，是引起全球性艾滋病蔓延的主要病原体(Gilbert et al.,2003,)，HIV-2型主要分布于西部非洲，毒力较弱，引起的AIDS病程长且症状轻。根据世界卫生组织(WHO)统计，2011年全球共约3400万名艾滋病病毒携带者和艾滋病患者，每年约有200万人死于AIDS，同时又有270万人新感染HIV，死亡人数中妇女和儿童占了一半以上，这给世界带来了巨大的危害。

目前，HIV病毒的检测有基于抗体的检测和基于核酸的检测、质谱分析和测序等方法。为了达到最大可能的准确性，HIV抗体检测分为筛查、复检和确认三个步骤，筛查、复检呈阳性反应的标本需要经过确认以后才能下结论，这是一个繁冗和耗时的过程。基于核酸的检测主要包括RT-PCR、恒温扩增和实时荧光定量PCR等。实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异型强，操作也非常简单，在当前HIV检测中应用非常广泛。

实时荧光定量PCR是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性；(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠；(4)不接触有毒试剂，操作安全；(5)有利于规模化、自动化及联网管理；(6)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

HIV病毒的逆转录酶因为缺乏校正修复功能，导致其变异频率非常高。不同亚型病毒包膜糖蛋白的氨基酸序列之间的差异在25％–35％之间，即使在某一特定亚型中包膜糖蛋白的氨基酸序列也存在高达20％的差异。针对HIV病毒的高变异性以及艾滋病流行趋势的严重性，还需要开发新的灵敏度高、特异性好的实时荧光PCR检测引物以及相应的检测产品。

发明内容

本发明的目的在于两个方面：

一方面提供一种用于检测HIV-1病毒载量的荧光引物，以及含有该荧光引物的用于以实时荧光RT-PCR检测样品中HIV-1病毒的试剂盒。

另一方面提供一种用于检测HIV-1病毒载量的引物对和探针序列，以及含有该引物对和探针的用于以实时荧光RT-PCR检测样品中HIV-1病毒的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供一对核苷酸序列，其特异性结合HIV-1病毒，可用作检测HIV-1病毒的引物对，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1GGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAA；

SEQ ID NO.2TAAACCCGAAAATTTTGAATT。

优选的，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述上游引物为荧光标记的引物(在本文中又称为“HFman引物”)，其中，所述上游引物的3’端标记有荧光报告基团，所述上游引物的5’端标记有荧光淬灭基团；或者所述上游引物的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团；所述下游引物包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选的标记方式是：所述上游引物的3’端标记有荧光报告基团，所述上游引物的5’端标记有荧光淬灭基团。

优选的，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640和CY5中的一种或多种；更优选为FAM。