[发明专利]一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，其特征在于，

上游引物5'GCTAGAAACAGGCCAACAAC 3'

下游引物5'GAGTAAACTGCCGCACTCAT 3'产物144bp

探针5'CCGCACTCATGATCCCCAT 3'，5’标记FAM,3’标记MGB

包括如下步骤：

步骤1：病毒核酸的提取

分别取PPV、PRV、PRRSV、BVDV、CSFV200μL，按生物病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒的说明方法提取总DNA/RNA；

步骤2：c DNA的合成

反转录采用10μL体系，反应管中依次加入5×Buffer、M-MLV反转录酶、RNasin、10mMdNTP、10μM下游引物和病毒RNA至10μL，反应后得到cDNA模板，保存备用；

步骤3：标准品制备

在25μL体系中进行目的DNA片段的PCR扩增，经目的DNA片段回收纯化、连接、转化及重组质粒提取，制备标准品；

步骤4：荧光定量PCR特异性试验

荧光定量PCR使用TAKARA TP800荧光定量PCR仪进行，反应体系为：Premix Ex Taq，上、下游引物，探针，模板和DDH₂O；经预变性，进行40个循环，采集荧光信号，进行TaqMan real-time RT-PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2中，反应管中依次加入：

2μL的5×Buffer；

0.5μL的M-MLV反转录酶；

0.25μL的RNasin；

1μL的10mM dNTP；

0.5μL的10μM下游引物；

再加入病毒RNA至10μL；

在42℃温度条件下，反应1h，或95℃温度条件下，反应10min，得到cDNA模板，放4℃温度条件下保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3包括如下步骤：

步骤31：目的DNA片段的PCR扩增

PCR扩增在25μL体系中进行，反应体系中加入：PremixEx Taq；上、下游引物；cDNA产物；DDH₂O；进行变性；

步骤32：目的DNA片段回收纯化

制作大孔琼脂糖凝胶，对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳；在紫外灯下迅速切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶块放置在离心管中，用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的条带，最后加30μLElution buffer洗脱DNA，保存于-20℃条件下备用；

步骤33：目的DNA片段的连接与转化

将大孔琼脂糖凝胶回收纯化后的PCR产物，采用pMD18-T载体DNA连接试剂盒，反应体系中加入试剂，试剂加完后瞬时离心，混匀，连接过夜，将连接产物加入感受态细胞DH5a中，混匀后，加入LB液体培养基培养，将培养物离心，过滤上清，再将沉淀混匀涂布于LB琼脂平板上培养；

步骤34：含目的DNA片段的重组质粒提取

挑取经PCR鉴定为阳性的菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，摇动培养过夜，用Axygen制备质粒试剂盒提取质粒，加入含有RNase的TE缓冲液中，水浴，在紫外分光光度计OD₂₆₀测定质粒的质量浓度，作为定量PCR的标准品，保存，备用。

4.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤31中，反应体系中加入：PremixEx Taq 12.5μL；上、下游引物各0.5μL；cDNA产物1μL；加DDH₂O至25μL；反应在95℃条件下变性5min；变性参数如下：在94℃条件下变性40s；在55℃条件下退火30s；在72℃条件下延伸30s；连续进行34个循环，循环结束后，在72℃条件下延伸5min。