[发明专利]一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，属于生物技术领域，包括如下步骤：病毒核酸的提取、c DNA的合成、标准品制备、荧光定量PCR特异性试验。本发明优化反应条件，建立定量PCR方法，方法特异性好，对PRV、PCV2、PPV、PRRRSV、BVDV均无扩增，敏感性高，检出限制为1.29copy，批内批间均有很好的重复性，该荧光定量PCR方法与传统兔体反应热方法相关性好，可在8～10h内完成大量样品检测，克服兔体实验的缺点，敏感特异，重复性良好，节省人力物力，减少实验兔的使用。

技术领域

本发明涉及一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪瘟CSF是由猪瘟病毒CSFV引起的一种高度接触性传染病，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一，OIE将其规定为必须申报的动物传染病之一，我国《家畜家禽防疫条例实施细则》将其列为一类传染病。

目前，疫苗接种是控制猪瘟的一种重要手段，广泛使用的疫苗是猪瘟兔化弱毒疫苗，用猪瘟兔化弱毒株接种易感细胞培养，收获培养物冻干而成，由于病毒本身不引起细胞病变，《中国兽药典》规定病毒含量和疫苗效力检验均是使用家兔，通过测定试验兔体温变化反应兔体感染量，实验繁琐、周期长、重复性差、结果受兔体差异和环境温度的影响，耗费大量人力物力，并且，随着对实验动物福利的重视，本着减少和替代的原则，也要求建立新的更快捷准确的代替检验方法来替代兔体法。

实时荧光定量PCR通过定量核酸分子的拷贝数，进而推算出细菌或病毒的感染滴度，此技术具有灵敏度高、特异性好、实时定量、高通量等一系列优势，广泛应用于基因表达水平、病原体定性和定量检测等方面。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，对同一个猪瘟病毒样品分别用定量PCR方法和兽药典规定的兔体反应热方法检测，确定二者之间相关性，用定量PCR方法替代兔子实验，以克服兔体实验的缺点，减少实验动物的使用，设计一对特异性引物和一条标记的探针，优化反应条件，建立定量PCR方法。方法特异性好，对PRV、PCV2、PPV、PRRSV、BVDV均无扩增；敏感性高，检出限制为1.29copy；批内批间均有很好的重复性。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，

上游引物5'GCTAGAAACAGGCCAACAAC 3'

下游引物5'GAGTAAACTGCCGCACTCAT 3'产物144bp

探针5'CCGCACTCATGATCCCCAT 3'，5’标记FAM,3’标记MGB

包括如下步骤：

步骤1：病毒核酸的提取

分别取PPV、PRV、PRRSV、BVDV、CSFV200μL，按生物病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒的说明方法提取总DNA/RNA；

步骤2：c DNA的合成

反转录采用10μL体系，反应管中依次加入5×Buffer、M-MLV反转录酶、RNasin、10mM dNTP、10μM下游引物和病毒RNA至10μL，反应后得到cDNA模板，保存备用；

步骤3：标准品制备

在25μL体系中进行目的DNA片段的PCR扩增，经目的DNA片段回收纯化、连接、转化及重组质粒提取，制备标准品；

步骤4：荧光定量PCR特异性试验