[发明专利]一种乳腺癌术后复发风险检测方法

权利要求书

1.一种乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备能够体现生物样本RNA信息的总核酸；

(2)在总核酸中加入与靶标RNA转录本相匹配的多重探针组，杂交并使用核酸连接酶激发连接反应；

(3)以(2)中所得的连接产物为模板，使用通用引物进行PCR反应；

(4)将(3)中PCR产物纯化，使用与通用接头序列兼容的测序仪或生物芯片仪，得到所有探针连接产物的序列丰度信息；

(5)通过生物信息学分析的方法，确定不同RNA转录本的相对表达量和序列信息。

2.根据权利要求1所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总核酸为直接提取的RNA；所述步骤(2)的多重探针组的特异碱基序列与对应的RNA转录本的碱基序列反向互补；所述的核酸连接酶具有催化RNA-DNA杂交链中单链DNA切刻连接反应能力；所述步骤(4)的纯化方法为通过标记有Oligo(dT)_N(15≤N≤35)的磁珠或亲和柱纯化RNA-探针双链连接产物复合物。

3.根据权利要求2所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述核酸连接酶为T4 DNA Ligase或Ligase。

4.根据权利要求1所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总核酸为RNA反转录得到的单链cDNA；所述步骤(2)的多重探针组中特异碱基序列应与对应的RNA转录本的碱基序列一致；所述的核酸连接酶具有催化DNA-DNA杂交链中单链DNA切刻连接反应能力；所述步骤(4)中的纯化方法为使用亲和素标记的磁珠或亲和柱纯化cDNA-探针双链产物复合物。

5.根据权利要求4所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述核酸连接酶选自T4 DNA Ligase、T3 DNA Ligase、Taq DNA Ligase、T7 DNA Ligase、9°N^TMDNA Ligase和Ligase-65的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的杂交温度为50-60℃；所述步骤(1)的制备方法为通过试剂盒提取或trizol提取的方法；所述步骤(3)中的通用引物为5UAP/3UA，所述PCR反应的条件为98℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸15s，共30-35个循环；所述步骤(4)的测序仪或生物芯片仪包括Illumina Hiseq、Miseq、Nextseq测序平台，Life Ion测序平台、Illumina、Affymetrix芯片平台。

7.根据权利要求1所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的多重探针组至少包括左探针和右探针两个片段；左探针包括5’通用序列和3’特异杂交序列，右探针包括经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用序列；左探针和右探针之间紧密相邻无碱基缺口，能够同时杂交在同一条核酸单链模板上，相邻探针可以被核酸连接酶催化连接为同一条核酸分子。

8.根据权利要求7所述的乳腺癌术后复发风险检测方法，其特征在于，所述左探针的5’通用序列和3’特异杂交序列以及右探针的经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用序列之间均能够添加8-15个随机碱基(dN)_8-15。

9.一种多重探针组，其特征在于，至少包括左探针和右探针两个片段；左探针包括5’通用序列和3’特异杂交序列，右探针包括经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用序列；左探针和右探针之间紧密相邻无碱基缺口，能够同时杂交在同一条核酸单链模板上，相邻探针可以被核酸连接酶催化连接为同一条核酸分子。

10.根据权利要求9所述的多重探针组的用途，其特征在于，所述探针组能够用于以下疾病的风险检测，所述疾病包括肿瘤、微生物感染、自闭症和遗传疾病。