[发明专利]一种乳腺癌术后复发风险检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与分子生物学领域，涉及RT-MLPA(逆转录-多重依赖扩增技术)及高通量测序技术与分子定量定性，尤其是对乳腺癌术后复发风险的检测方法。

背景技术

目前，乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率较高，并呈上升趋势。乳腺癌的发生是由于多种因素综合所导致，如环境因素，生活习惯，激素水平，遗传因素等，其中遗传因素的作用最为显著。乳腺癌的治疗近20年来主要采用以手术为中心，化疗、放疗、内分泌治疗为辅助的综合治疗模式，降低了乳腺癌的复发和死亡率。但是有相当一部分化疗获益甚少的低复发风险患者也不得不接受化疗，这导致了资源的浪费和对部分低危者的过度治疗。病人选择什么样的治疗，特别是早期乳腺癌时是否需要辅助化疗的疑问迫切地需要得到解决。检测乳腺癌复发风险主要是通过检测肿瘤组织中21个基因的转录产物mRNA的相对表达量，通过表达量计算复发评分RS值。

作为用于评估正常生命过程、病理发展和对治疗的药物反应的指标，生物标志物可以作为区分疾病状态、疾病进展、对临床干预进行评估的预后和预测的有效替代终点。生物标志物范围广泛，不仅包括细胞水平、蛋白水平和代谢水平的指标，还包括了特定基因的转录水平差异和体细胞突变。

目前分析基因转录RNA表达量主要有RNA转录组水平和单基因RNA表达两个检测方向。RNA转录组检测一般使用高通量RNAseq或者表达基因芯片或数字表达谱技术；单基因转录组水平的检测主要依靠逆转录-荧光定量PCR技术。目前研究表明RNA表达水平作为有效的生物标记物往往不止需要一个基因，而是需要相关的多个基因的表达水平作为符合指标，转录组水平的基因表达检测一般用于无假设条件的生物标志物筛选，但由于其较高的RNA质量和数量并不适合作为临床检测。RT-qPCR作为检测RNA表达水平的金标准往往用于低通量的RNA表达检测，不适合多基因转录水平联合检测。

多重连接依赖的扩增技术(muitiplex ligation-dependent probe amplication，MLPA)的中等通量基因检测方法，可在同一反应管内对多大45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。MLPA技术因其精确度高、重复性好和操作简便等优势，广泛应用于肿瘤相关基因检测等领域，如单核苷酸多态性和基因突变检测、基因的大片段缺失和重复、染色体数目变异、甲基化检测分析等，成为肿瘤分子诊断领域的研究热点。MLPA技术是在多重扩增探针杂交技术的基础上改进并设计的一种具有高通量、高效率及低成本，可对待检测核苷酸序列定性和相对定量分析的基因分析技术。其基本原理是特殊合成的探针与靶序列DNA杂交，通过杂交探针的连接、PCR扩增，得到的PCR产物再经毛细管电泳分离，收集数据分析最后得出结论，目前已广泛应用于肿瘤相关基因的检测。但由于其检测技术基于毛细管电泳的片段化分析，所以其多重检测能力局限在45重，而且只能半定量分析，其定量的灵敏度不高。

目前，二代高通量测序技术由于其更加准确、灵敏、具有更高的通量，并随着价格的不断降低，其应用范围不断扩大，已涉及生命科学研究以及医学研究的各个不同方面。利用高通量测序技术来进行高通量的基因检测是目前的研究热点之一。但是，二代测序技术都需要进行文库的构建，然后使用构建好的文库进行上机测序。一般步骤主要包括DNA/RNA的提取、片段化、末端修复、加接头、片段选择、扩增及上机测序，最后是数据的分析。而在这些环节中，文库构建比较费时费力。使用这种方法适合对基因组进行测序，如果对其中的某些基因感兴趣，或只对特定部分测序，这种建库方法就会造成浪费，并增加数据分析的难度。同时，这种方法需要的核酸起始量高，很难进行大规模样本的同时测序，也不适用于临床样本。

对特定的某些感兴趣基因测序则需要目标序列富集等额外的建库步骤。通过杂交进行目标序列捕获富集是目前应用最为广泛的方法。应用较为广泛的目标序列捕获技术主要基于固相杂交捕获(Choietal.2009)或液相杂交捕获技术(Bainbridge et al.2010)。现在有商业化的定制捕获试剂盒可以使用。这些商业化的定制序列捕获试剂盒一般价格昂贵，一旦芯片定制后检测目标序列就被固定，位点的选择不灵活。