[发明专利]使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途

权利要求书

1.使人体的单个核细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液，其特征在于：所述的 一组培养液包括细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3；

所述的细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3在10～100级洁净度的安全操作台里操作，4～10℃的低温条件下配制；

细胞培养液A1的配制：

在500mL DMEM培养液中加入以下成分：

10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、 10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经 生长因子和10μM的二甲亚砜；充分溶解，然后经0.22微米 孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A1；

细胞培养液A2的配制：

在500mL DMEM培养液中加入以下成分：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素 6、10ng/mL的神经生长因子和10ng/mL的干细胞因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A2；

细胞培养液A3的配制：

在500mL DMEM培养液中加入以下成分：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的神经生长因子、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8、10ng/mL的表皮生长因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox、10ng/mL的FGFR1 特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子； 10ng/mL的神经营养因子-3、10ng/mL的血管内皮生长因子和 10ng/mL的生长因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配 制成细胞培养液A3。

2.一种用于制备自体视网膜干细胞的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的一组培养液。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括人体的单个核细胞。

4.权利要求1所述的一组培养液和权利要求2-3任意一项所述的试剂盒在制备用于治疗涉及视网膜再生再造和修复的疾病的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的涉及视网膜再生再造和修复的疾病为视 网膜组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性病 变。

6.一种使人体的单个核细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的制备方法，其特征在于：所述 的制备方法包括以下步骤：

(1)将自体来源的人体单个核细胞作为原料细胞以2×10⁶-5×10⁶的密度接种于细胞培养皿中；

(2)在37℃和5％的CO₂的环境中，将原料细胞在细胞培养液A1中培养3天，得到细胞1；所述的细胞培养液A1为含有以下成分的DMEM培养液：

10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、 10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经 生长因子和10μM的二甲亚砜

(3)在37℃和5％的CO₂的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液A2中培养3～6天，得到细胞2；所述的细胞培养液A2为含有以下成分的DMEM培养液：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素 6、10ng/mL的神经生长因子和10ng/mL的干细胞因子；

(4)在37℃和5％的CO₂的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液A3中培养3～6天，得到细胞3，细胞3即为自体视网膜干细胞；所述的细胞培养液A3为含有以下成分的DMEM培养液：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10μM的RHO激酶抑制剂Y-27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的神经生长因子、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8、10ng/mL的表皮生长因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制剂RepSox、10ng/mL的FGFR1 特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子； 10ng/mL的神经营养因子-3、10ng/mL的血管内皮生长因子和 10ng/mL的生长因子。