[发明专利]使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物医学技术领域，更具体涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的细胞培养方法、试剂盒和应用。所述的制备方法通过将自体细胞作为原料细胞依次经细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3培养后得到血源性自体视网膜干细胞。本发明应用人自体血液细胞作为原料细胞，使之逆向分化生产人血源性自体视网膜干细胞。本发明应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生血源性自体视网膜干细胞。本发明在生产速度、产量、纯度方面均明显优于现有技术。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物医学技术领域，更具体涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的细胞培养方法、试剂盒和应用。

背景技术

视网膜是位于眼底的中枢神经系统特化的一部分,起源于神经外胚层，是一层对光敏感的、精细的膜样结构，是形成各种视功能的基础。由胚胎时期神经外胚叶形成的视杯发育而来，视杯外层形成单一的视网膜色素上皮层，视杯内层则分化为视网膜神经感觉层。视网膜神经感觉层由外向内分别是:视锥、视杆层，外界膜，外核层，外丛状层，内核层，内丛状层，神经节细胞层，神经纤维层，内界膜(属Müller细胞的基底膜)。

眼底疾病多数会导致严重的致盲眼病，视网膜神经元的不可逆性的丢失是许多眼底疾病的最终结局，主要有各种视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性。目前尚无有效的治疗方法。如何地治疗和预防眼底性疾病，再生和修复视网膜病变和黄斑病变，恢复眼底疾病患者的视功能，是当今神经科学领域面临的挑战。近10年来，国内外医学界利用视网膜干细胞修复各种视网膜变性和损伤，给各种视网膜疾病、黄斑变性等致盲性眼底疾病的治疗和预防带来了曙光。

目前，应用型的视网膜干细胞多来源于：1、胚胎干细胞(ESCs)诱导的异体视网膜干细胞；2、睫状上皮来源的干细胞或祖细胞，在体外进行培养；3、脐带血干细胞/间充质干细胞来源的视网膜细胞；4、诱导的多能干细胞(IPS)来源的视网膜干细胞。

中国专利申请201480066229公开了一种提供用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的胚胎干细胞(ESC)以产生并生长所述分离的ESC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的ESC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使(a)的所述分离的ESC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。然而通过ESC诱导制备视网膜干细胞的方法通常耗时较长，诱导产生时间需要8-15周，此外其制备的视网膜干细胞在应用时也会出现异体免疫排斥反应。

睫状上皮来源的干细胞或祖细胞，在体外进行培养也有可能分化形成视网膜干细胞，然而研究已经证明睫状体细胞并不是真正意义上的视网膜干细胞，因此不适合应用于视网膜再生的治疗。

中国专利申请201510636044公开了一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法。通过将骨髓间充质干细胞优化培养和诱导分化，提高了其分化为视网膜神经前体样细胞效率，其移植效果与视网膜前体细胞具有相似的功效，使移植区视网膜功能有效改善，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了一种理想的细胞来源。然而脐带血干细胞/间充质干细胞来源的视网膜细胞的方法，存在体外培养时间长达数周，稳定性差，污染率高，获得的视网膜细胞数量少，产量极少，生物特性不稳定等问题。

中国专利申请201210301765公开了一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法。该方法，将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞在含有N₂的培养基中诱导后，转入含有神经基础培养基、敲除的血清替代物和烟酰胺的视网膜诱导培养基，获得视网膜前体细胞。诱导的多能干细胞(IPS)是一种转基因式的自体多能干细胞，然而其致癌风险高，生产工艺复杂，时间长，应用安全性引起严重关注。