[发明专利]一种高产β-1,3-葡聚糖枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产β‑1,3‑葡聚糖枯草芽孢杆菌菌株及其发酵培养方法。其特征是发明人从土壤中筛选得到菌株ZJS‑1，分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis。保藏号是：CGMCC No.12176。本发明的菌株ZJS‑1通过发酵培养直接转化蔗糖合成β‑1,3‑葡聚糖，即直接以蔗糖为碳源，通过生物转化合成β‑1,3‑葡聚糖。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产β-1,3-葡聚糖枯草芽孢杆菌菌株及其发酵培养方法。

背景技术

β-1,3葡聚糖是一类主链结构由β-1,3-糖苷键连接，通常含有不同比例和大小的β-1,3，β-1,4，β-1,6糖苷键连接的支链的大分子多糖。20世纪60年代，就已证明β-1,3葡聚糖具有增强哺乳动物免疫活力、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合等作用，显示了其在药学领域的潜在应用价值，受到广泛的关注；近年来的研究表明，β-1,3葡聚糖应用在日化产品中，可以起到保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性的作用，应用于畜禽养殖可以增强畜禽的机体免疫力、改善胃肠功能等，进一步拓展了β-1,3葡聚糖应用领域。

传统上生产β-葡聚糖的方法是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。由于受到原料生产规模、生产周期的限制，通过提取方式生产β-葡聚糖远远不能满足的市场需求。为了改进β-葡聚糖生产方式，提升β-葡聚糖的产量，近年来，国内外研究中开展了高产β-葡聚糖的微生物的筛选研究，目前已经筛选出的适于规模化生产β-葡聚糖微生物包括啤酒酵母、枯草芽孢杆菌等，国外已经开展了通过微生物发酵培养规模化生产β-葡聚糖细菌来源的β-葡聚糖酶的尝试，但我国微生物发酵生产β-葡聚糖的相关研究起步较晚，以啤酒酵母为主，其他来源较少。但啤酒酵母生产β-葡聚糖仍存在原料转化利用率低，产品纯度低、品质差等缺点，难以适应当前市场对高品质β-葡聚糖的需求。

发明内容

本发明公开了一种高产β-1,3-葡聚糖枯草芽孢杆菌菌株ZJS-1。本发明的菌株ZJS-1通过发酵培养直接转化蔗糖合成β-1,3-葡聚糖，即直接以蔗糖为碳源，通过生物转化合成β-1,3-葡聚糖。

发明人通过菌落拉丝法和液体培养物中葡聚糖产量的方法从南京市钟山风景区林下土壤中筛选得到，命名为ZJS-1，该菌菌落呈白色，粗糙褶皱，边缘不整齐。分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是：CGMCC No.12176。保藏时间：2016年3月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究微生物研究所。

高产β-1,3-葡聚糖菌株的筛选：

按照KH₂PO₄ 0.3-1.0g/L；CaCl₂ 0.3-1.0g/L，MgSO4 0.6-1.2g/L，FeSO₄·7H₂O0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，琼脂12.0-18.0g/L的浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH6.5-7.0，115-121℃灭菌20-30分钟；制成筛选培养基；将采集的用于筛选的土样0.5-1.5g或水样1-2mL加入5mL液体培养基中，于30℃摇床中振荡培养48-72h用于富集产葡聚糖菌，之后将48-72h培养物以5％的接种量涂布于筛选平板培养基中，25-30℃倒置培养48-72h，利用菌落拉丝法检测各菌落的拉丝性能，选取具有明显拉丝性能的菌落转接到5-8mL筛选液体培养基中，28-32℃，150-300rpm震荡培养24-48h，取样利用刚果红法测定各培养物中β-1,3-葡聚糖含量，选取β-1,3-葡聚糖含量最高的菌株，筛选结果见图1。由图1可知，1号菌株ZJS-1的β-1,3-葡聚糖产量最高，因此选取菌株ZJS-1为高产β-1,3-葡聚糖的菌株，对其进行遗传分析和培养条件优化。

产β-1,3-葡聚糖菌株的16S rDNA鉴定：