[发明专利]一种敲除野生型T细胞TCRalpha链的gRNA及方法

权利要求书

1.一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述gRNA的编码DNA，其特征在于，所述gRNA的编码DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述gRNA在敲除野生型T细胞TCR alpha链中的应用。

4.一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于：所述方法利用CRISPR/Cas9技术，通过如权利要求1所述gRNA和CRISPR/Cas9共感染T细胞，敲除野生型T细胞TCR alpha链，构建野生型TCR alpha链缺失的T细胞。

5.根据权利要求4所述的敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于，所述gRNA的启动子为U6启动子。

6.根据权利要求4所述的敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)gRNA靶位点的设计，合成编码gRNA的DNA序列；

2)将步骤1)中合成的DNA片段和酶切过的CPRISPR/cas9表达载体进行连接，构建gRNA/CPRISPR/cas9表达载体；

3)将步骤2)构建的gRNA/CPRISPR/cas9表达载体和第三代慢病毒的包装载体共感染293T细胞，生成包含gRNA/CPRISPR/cas9基因的慢病毒，用慢病毒转染正常人T细胞，完成敲除野生型TCR alpha链，获得野生型TCR alpha链缺失的正常人T细胞。

7.根据权利要求6所述的敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于，所述正常人T细胞为正常人周围血T细胞。

8.根据权利要求6所述的敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于,所述酶为BbsI酶。

9.根据权利要求6所述的敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，其特征在于，所述步骤1)中，合成针对TCR alpha链gRNA的DNA编码序列的方法为：在与gRNA对应的DNA序列的5’末端加上CACC得到正向核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向核苷酸序列，分别合成正向和反向核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到双链DNA片段。