[发明专利]一种敲除野生型T细胞TCRalpha链的gRNA及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，尤其是涉及一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法。

背景技术

肿瘤是目前人类健康的最大杀手，现有的治疗手段包括手术，化疗，放疗都无法彻底清除肿瘤，免疫T细胞治疗为肿瘤患者的康复带来了巨大希望。目前免疫T细胞治疗的方法主要有CAR-T和TCR-T细胞技术，这些T细胞治疗的原理是将肿瘤特异性的chimeric antigen receptor(CAR)或者T cell receptor(TCR)基因转染到正常T细胞上面，使之获得肿瘤特异性识别的能力，从而杀死肿瘤细胞。然而，由于正常T细胞含有自身的T细胞受体(野生型alpha和beta链)，这些野生型的alpha和beta链可以影响CAR-T或者TCR-T的表达，导致CAR-T或者TCR-T的活性降低；或者在受者体内攻击肿瘤外的靶器官和组织，导致供体对受体的移植免疫反应病(GVHD，graft verus host disease)病；或者野生型的TCR alpha和beta链和肿瘤特异性的TCR alpha和beta链产生错配，导致T细胞获得新抗原识别能力，损害受体组织。因此，基因敲除野生型TCR alpha和beta链是保证CAR-T或者TCR-T细胞免疫治疗安全性的重要措施。通过敲除野生型TCR alpha和beta链，我们可以提高CAR-T或者TCR-T的功效，减少GVHD的发生，消除TCR alpha和beta链的错配现象，大大提高免疫T细胞治疗肿瘤的效果。

目前基因修饰技术有RNAi干扰技术，ZFN(锌指核酸酶技术),TALEN(转录激活样酶技术)，已有人用这些技术进行TCR野生型的alpha和beta链的敲除工作。敲除后的T细胞不表达野生型的alpha和beta链，不引起GVHD病，发生TCR错配的可能性大大降低。然而，以上技术在实际应用中也存在许多不足，其中，RNAi技术仅仅在RNA水平上面降低野生型alpha和beta链的表达，而且是不完全的敲除，残余的RNA可以继续表达TCR的蛋白分子；ZFN技术需要制备多个载体，在体外转录成RNA后转入T细胞才可以敲除基因，RNA不稳定，制备繁琐；Talent技术同样需要制备多个载体后才可用，而且转染的效率比较低，影响TCR野生型alpha和beta链的敲除效率。

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关的Cas9蛋白系统(CRISPR/Cas9)是一种在细菌和古细菌中广泛存在，并用于抵御外源病毒感染的天然防御机制。外源的DNA入侵细菌和古细菌后，会被细胞中与外源DNA特定区域互补的RNA引导序列(gRNA)识别，并引导Cas9核酸酶到达识别部位，对目标序列进行酶切，从而降解外源DNA。根据这个特性，CRISPR/Cas9技术广泛用于基因编辑，其基本步骤是将基因特异性的gRNA和CRISPR/Cas9基因联合，共同转入细胞中。在gRNA的引导下，CRISPR/Cas9特异性地敲除某个基因。CRISPR/Cas9基因敲除效率高，制备相对简易。已经成为基因修饰的主流技术。

针对野生型TCR alpha链，我们通过联合使用gRNA和CRISPR/Cas9的技术，敲除T细胞中的野生型TCR alpha链，构建安全可应用的TCR alpha链缺失的T细胞，用于CAR-T或者TCR-T的免疫T细胞治疗。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA。

本发明的第二个目的在于提供一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

一种所述gRNA的编码DNA，所述gRNA的编码DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

所述核酸序列如下：

SEQ ID NO:1：CACCGGAGAAUCAAAAUCGGUGAAU；

SEQ ID NO:2:CACCGGAGAATCAAAATCGGTGAAT。

本发明提供一种所述gRNA在敲除野生型T细胞TCR alpha链中的应用。

一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的方法，所述方法利用CRISPR/Cas9技术，通过所述gRNA和CRISPR/Cas9共感染T细胞，敲除野生型T细胞TCR alpha链，构建野生型TCR alpha链缺失的T细胞。