[发明专利]一种诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法

说明书

本发明提供了一种诱导SH‑SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，采用以下步骤：SH‑SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH‑SY5Y细胞的细胞悬液；将上述细胞悬液铺板于培养皿以诱导培养基培养，获得多巴胺能神经元。本发明诱导SH‑SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用含有aFGF、TPA、毛喉素（Forskolin）、dbcAMP和普拉克索的诱导培养基培养SH‑SY5Y细胞后，可将其诱导为多巴胺能神经元，并可以分泌多巴胺；在优化条件下，多巴胺能神经元分化率约为15%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的5%，分化率高、分化水平高。

技术领域

本发明涉及神经科学研究领域的细胞转分化技术，特别涉及一种诱导SH-SY5Y细胞（人神经纤维母细胞瘤细胞）分化为多巴胺能神经元的方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常发生于中老年人的神经退行性疾病，临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等。其发病率有随着年龄增长而有增加的趋势，给患者的生活和工作带来诸多不便。PD的主要病理改变为中脑黑质多巴胺神经元的变性坏死，科研上使用的小鼠PD模型，常常是用6-OHDA、MPTP等构建的模型，其原理就是造成黑质纹状体的多巴胺能神经元大量死亡，使小鼠表现出PD的典型症状。

多巴胺能神经元主要位于大脑的黑质致密部，也存在于中脑的腹侧被盖区，一些多巴胺能神经元位于弓状核下丘脑。这些神经元使用神经递质多巴胺传送信息给身体。多巴胺控制大脑的许多功能，包括情绪，压力和肌肉控制。缺乏多巴胺能神经元可能引起帕金森氏病。多巴胺能神经元是身体产生多巴胺的主要来源，缺乏多巴胺可能导致不自主的肌肉运动，是帕金森氏病的主要症状。酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydrolase，TH）是多巴胺能神经元中含有的一种酶，多巴胺能神经元可以从细胞外摄取酪氨酸，在胞浆内经TH催化形成左旋多巴，再经芳香族氨基酸脱羧酶催化形成多巴胺。TH蛋白是多巴胺能神经元的重要特异性标记物。多巴胺转运蛋白（Dopamine transporter, DAT）主要存在于纹状体、伏隔核等多巴胺能神经元密集的核团，对突触间隙内的多巴胺能水平起调控作用。DAT对于多巴胺能神经元行使正常的生理功能是必需的，是成熟神经元的重要特异性标志物。

SH-SY5Y细胞系为人神经纤维母细胞瘤细胞株，是目前体外探讨老年痴呆症、PD病等神经退行性疾病发病机制的常用细胞模型，也是体外筛选抗神经退行性疾病药物的细胞模型之一。但SH-SY5Y细胞是未分化状态的细胞，与体内高度分化的神经细胞相比，无论在表观形态学还是在胞内物质代谢、基因表达上都存在差异，必然影响实验结果。也有学者使用维甲酸（RA）分化SH-SY5Y为神经元后，将其作为研究PD等病的细胞模型，相比较SH-SY5Y而言，神经元同多巴胺能神经元更为相似，但是RA作为一种强烈的畸胎剂，可以扰乱分化出的神经元的结构和特性，有可能在结果上与多巴胺能神经元产生分歧。科研上也有使用分化神经干细胞（neural stem cell，NSC）为多巴胺能神经元作为模式细胞，但是NSC一般来源于胚胎的前脑、中脑，往往有伦理学上的应用局限，而且作为细胞模型，又需要有大量而稳定的细胞储备。

发明内容

为了解决当前缺乏合适的研究帕金森病（PD）的细胞模型的问题，本发明提供了一种高效由SH-SY5Y细胞诱导分化为多巴胺能神经元的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，采用以下步骤：

（1）SH-SY5Y细胞培养：SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞的细胞悬液；

（2）诱导分化：将步骤（1）的细胞悬液铺板于培养皿以诱导培养基培养，获得多巴胺能神经元。