[发明专利]一种野生百合组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于花卉培育技术领域，具体地，涉及一种野生百合组织培养方法。

背景技术

百合在世界观赏花卉生产中占有重要地位，随着市场需求量的不断增加，人们对百合花的品种质量要求也越来越高，人们对百合野生品种资源、野生百合的组培繁殖以及试管苗生长发育做了大量研究，从依靠鳞片扦插由子球培育成母球的传统的百合种球生产到百合组培快繁。由于百合地下鳞茎数量多，易于获得，取材不受季节限制而成为目前百合组培最主要的外植体材料，但鳞茎生长于地下，带菌多，使得组培消毒过程中难度加大。

目前百合组培苗的获得均采用常规的组织培养方法，但是，在组织培养早期常出现大面积的真菌污染，继代过程中还会出现内生细菌的再次污染，造成了材料的损失，同时浪费了大量的人力物力，故长期以来高污染率是困扰野生百合组织培养的难题。目前，对如何降低野生百合组培过程中的污染率已有相关研究报道，一方面是对组培过程各环节进行严格控制，另一方面是使用表面消毒剂对材料进行消毒如抗生素、次氯酸钠、氯化汞等。但这些消毒剂或达不到很好的污染防控作用，或对材料有伤害并对操作人员及环境有危害。因此，如何寻找一种高效易于操作且污染率小的组织培养技术，是野生百合组培过程中亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种野生百合组织培养方法。该方法从外植体的选择和组织培养个阶段使用的培养基成分调整角度出发，从组织培养的源头和过程对污染率进行控制，从而减小污染率，且该方法易于操作，简单易行。

根据本发明提供的一种野生百合组织培养方法，包括如下步骤：

（1）诱导愈伤组织：取野生百合蒴果，将蒴果切开，选取生长健壮、胚明显的种子，除去种皮经消毒后接种在愈伤组织诱导培养基上，接种时控制种子长度的三分之二埋在培养基内，培养20-40天后，获得直径为0.3-0.5cm的淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织团块，所述愈伤组织诱导培养是在完全黑暗、温度为20-24℃的条件下进行；

所述愈伤组织诱导培养基配方为：1/2MS、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.3mg/L、α-萘乙酸0.6-1.0mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1-0.4mg/L、氯化钠0.1-0.3mg/L、杀菌中草药粉0.1-2mg/L、葡萄糖20-26g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8；

（2）愈伤组织的继代培养：愈伤组织诱导培养完成后，接种到继代培养基上进行继代培养，所述继代培养是在完全黑暗、20-25℃的继代培养条件下进行；

所述继代培养的培养基配方为：1/2MS、2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.1mg/L、2，4-D 0.6-1.1mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1-0.3mg/L、氯化钠0.1-0.2mg/L、杀菌中草药粉0.1-1.5mg/L、果糖20-25g/L、琼脂7-9g/L，pH值为5.6-5.8；

（3）愈伤组织的扩增培养：愈伤组织团块在继代培养基上继代培养4个月后，将愈伤组织团块分切成0.2-0.5cm的小块，接种到扩增培养基上，进行弱光培养，弱光培养是指在光照100-700lux、温度25℃的条件下进行；

所述扩增培养基配方为：1/2MS、2，4-二氯苯氧乙酸0.2-1.1mg/L、2，4-D 0.3-1.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1-0.3mg/L、氯化钠0.1-0.3mg/L、杀菌中草药粉0.1-1.1mg/L、麦芽糖18-27g/L、土豆泥0.2-2g/L、琼脂6-10g/L，pH值为5.6-5.8。

优选地，所述消毒的具体方法为将除去种皮的种子洗净后置于浓度为5-7%的盐水中浸洗10-20min，然后用蒸馏水冲洗0.5-1h，再用75％酒精浸泡0.5-2min。

优选地，所述中草药的成分包括金银花、黄芩、艾草、槟榔、蒲公英。

优选地，所述诱导愈伤组织的操作在超净工作台上完成。

优选地，所述愈伤组织诱导培养完成后，接种到继代培养基上之前，在超净工作台上用解剖刀切除愈伤组织团块中褐色部分。

优选地，所述愈伤组织的继代培养过程中，每个装有继代培养基的培养皿中接种10-20块愈伤组织团块，愈伤组织团块的直径为0.2-0.4cm，每4周继代培养一次。

优选地，所述将愈伤组织小块接种到扩增培养基之前，先接种到含继代培养基的培养皿上，用经灭菌后的保锡纸包裹三层后，进行10-20天的低温处理，低温处理条件为1-4℃。

优选地，所述灭菌是采用紫外线照射进行灭菌。