[发明专利]一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方法，其特征在于：

a) 通过hPD-L2基因的获取和克隆以及重组质粒pET-22b-hPD-L2的构建；

b) 制备Rosseta^TM (DE3)的感受态细胞，将a)获得的重组质粒转入该感受态细胞中，获得重组菌株；

c) 在22 ℃、200 rpm、0.8 mM异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导b)获得的重组菌株8 h，获得hPD-L2蛋白的大量表达；

d) 采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化c)获得纯度较高的hPD-L2重组蛋白；对纯化后的重组蛋白利用浓缩管进行浓缩，获得高浓度的hPD-L2重组蛋白；

具体方法包括如下：

1) 以人源程序性死亡因子配体PD-L2的全长编码基因为模板，利用PCR技

术获得hPD-L2整个胞外段基因，利用Nde I与Xho I限制性内切酶同时双酶切PCR产物与载体pET-22b，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至公司进行基因测序，测序成功，获得pET-22b-hPD-L2重组质粒；

3) 制备Rosseta^TM (DE3)的感受态细胞，将步骤2)获得的pET-22b-hPD-L2重组质粒转化至Rosseta^TM (DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落，于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的LB

培养基，在37 ℃条件下过夜培养获得接种液，接种液按照1：100的体积比接入1 L含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.8 mM的IPTG于22 ℃诱导8 h，收集菌体；

5) 将上述菌体重悬于裂解缓冲液PBS中，超声破碎，离心，收集上清；

6) 将步骤5)获得的上清，利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；

7) 将步骤6)中收集的目的蛋白洗脱液装进透析袋中，利用PBS缓冲液进行蛋白透析；

8) 将步骤7)中透析后的hPD-L2蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得的hPD-L2蛋白；

所述hPD-L2蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方

法，其特征在于：所述hPD-L2的基因片段长度为600 bp，编码200个氨基酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方

法，其特征在于：所述步骤2)中连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1：3；所述步骤3)中重组质粒和Rosseta^TM (DE3)感受态细胞体积比为1：60。

4.根据权利要求1所述的一种人源程序性死亡因子配体hPD-L2蛋白的制备方

法，其特征在于：所述步骤5)中裂解缓冲液PBS中含有： 122 mM NaCl，2.7 mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4。