[发明专利]一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及一种人源程序性死亡因子配体PD‑L2（hPD‑L2）蛋白的制备方法，属于重组蛋白的制备方法技术领域。本方法采用PCR技术对整个胞外区进行扩增，并与pET‑22b载体进行连接，构建融合表达重组质粒，转入原核表达系统Rosseta^TM(DE3)宿主菌诱导表达hPD‑L2蛋白，获得上清表达的hPD‑L2蛋白，然后利用Ni‑NTA柱亲和层析纯化，获得高纯度、高稳定性、构象均一的蛋白。本发明制备的hPD‑L2蛋白可作为抗原免疫Balb/c雌性小鼠，用于制备单克隆抗体。通过本发明制备的hPD‑L2蛋白具有流程简便、周期短、成本低、获得的蛋白纯度高与均一性高的特点。

技术领域

本发明属于重组蛋白的制备方法技术领域，具体涉及一种人源程序性死亡因子配体hPD-L2蛋白的制备方法。

背景技术

PD-L2作为B7家族的第5个成员，曾被命名为B7-DC或BTDC，是程序性死亡因子1（Programmed Death- 1，PD-1）的主要配体之一。B7家族是仅可以从抗原递呈细胞APC单向传递信号至T细胞的共刺激分子。在T淋巴细胞增殖过程中，PD-L2信号通路充当免疫反应负性反馈调节信号，在免疫调节方面起十分重要的作用。PD-L2与T细胞表面的PD-1受体结合后通过PD-1-PD-L2信号通路调控T细胞增殖及细胞因子分泌，负性调节T细胞活化并促进T细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。该信号通路作为重要的细胞周期检查点，发挥着特异性的抗原依赖性负性调控作用，是药物干涉机制以及抗肿瘤免疫治疗的靶分子之一，具有潜在的临床应用价值。hPD-L2蛋白可作为抗原提供抗体结合的表位，该蛋白的制备是后续hPD-L2单克隆抗体制备的前提条件，也为单克隆抗体的制备奠定基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方法。

为此采用如下的技术方案：

一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白，氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

所述的蛋白质为如下1)-2)所示的蛋白质：

1) 氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示组成的蛋白质；

2) 将SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列进行一个和或几个

氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；

一种人源程序性死亡因子配体PD-L2蛋白的制备方法，采用如下步骤：

1) 以人源程序性死亡因子配体PD-L2的全长编码基因（序列号为NM 025239.3）为模板，利用PCR技术获得hPD-L2整个胞外段基因，利用Nde I与Xho I限制性内切酶同时双酶切PCR产物与载体pET-22b，利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至公司进行基因测序，测序成功，获得pET-22b-hPD-L2重组质粒;

3) 制备Rosseta^TM (DE3)的感受态细胞，将步骤2)获得的pET-22b-hPD-L2重组质粒转化至Rosseta^TM (DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落，于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的LB培养基，在37 ℃条件下过夜培养接种液，接种液按照1：100的体积比接入1 L含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.8 mM的IPTG于22 ℃诱导8 h，收集菌体；