[发明专利]仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法

权利要求书

1.仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：包括如下步骤，

第一步，样本收集；

第二步，粪便样本大肠杆菌的分离及鉴定；

第三步，血清型鉴定；

第四步，毒力因子结果检测；

第五步，含有多种毒力因子大肠杆菌的全基因组测序分析；

第六步，全基因组序列分析。

2.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：所述的样本收集从猪场收集了400份仔猪腹泻粪便样本，每个猪场都有基础母猪500头以上；仔猪饲养在水泥带排孔的地面。

3.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第二步具体包括，

(1)粪便样本培养于含有5％血清的胰蛋白胨培养基中，37℃培养20h；

(2)从胰蛋白胨培养基中挑取细菌克隆进一步培养于麦康凯固体培养基，37℃培养20h；经过3代纯化，挑取细菌克隆进一步培养于LB固体培养基，37℃培养12h；

(3)将步骤(2)经过LB固体培养基得到的分离菌纯培养物分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁培养基培养试验，逐一鉴定筛选，以大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的大肠杆菌菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验。

4.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第三步具体为，将大肠杆菌分离菌于121℃培养2h，提取菌体抗原；应用171种O抗血清进行玻片凝集试验检测O抗原，NaCl作为阴性对照，阳性结果应用试管凝集实验进一步确认实验结果。

5.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第四步具体为，

应用PCR方法检测分离菌株的毒力因子sta,stb,astA,eaeA,stx2e,F4,F18,sepA；PCR产物应用0.8％的琼脂糖凝胶进行分离鉴定。

6.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第五步具体为，

对含有sta、F18、eae A、stx2e、sepA毒力因子的大肠杆菌进行测序分析；基因组序列采用Hiseq2000测序系统进行全基因组测序；将大肠杆菌基因组DNA使用nanodrop2000和Aglent2100做质检，检测合格后进行文库制备和文库质检；PE100下机数据进行质检，得到合格数据clean data，将clean data分别做de novo拼接，使用Glimmer3.0程序对基因ORF序列进行预测，将ORF序列与NCBI nt数据库和大肠杆菌全基因数据库进行比对，对预测的基因进行校对；将ORF序列与KEGG和GO数据库进行比对，对预测的基因进行功能注释。

7.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第六步具体为，

血清型确定通过O抗原加工系统基因wzx,wzy,wzm，wzt，确定O抗原，鞭毛蛋白基因fliC,flkA,flmA,flnA及fllA确定H抗原；关于O,H抗原基因的数据库来源于NCBI核酸序列库；应用JSpecies确定大肠杆菌平均核酸同源性分析；应用BLASP软件分析毒力因子及耐药基因；以大肠杆菌O157:H7,O145:H28及O104:H4全基因组序列作为参考；应用VFDB病原菌毒力因子数据库作为毒力因子分析的参考数据库；应用RGI软件及CARD数据库对耐药基因进行注释。