[发明专利]一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 201710596167.2 | 申请日： | 2017-07-20 |
| 公开（公告）号： | CN107384876B | 公开（公告）日： | 2020-06-26 |
| 发明（设计）人： | 张涛;赵炳武;王永伟;孙聪;王咏梅 | 申请（专利权）人： | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/02 | 分类号： | C12N7/02;G01N33/569;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙) 11017 | 代理人： | 韩登营 |
| 地址： | 011517 内蒙古自治区呼和浩特市*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 口蹄疫 疫苗 146 含量 检测 标准 抗原 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)使用传代细胞接种口蹄疫病毒，培养口蹄疫病毒，经冻融处理，并离心除去细胞碎片；
步骤(2)对步骤(1)所得的口蹄疫病毒进行浓缩；
步骤(3)使用二氯甲烷对所述步骤(2)中所述浓缩后的口蹄疫病毒液进行抽提纯化，二氯甲烷浓度为4％-6％，室温下搅拌后静置过夜，离心，收集上清液；
步骤(4)对所述步骤(3)纯化后的口蹄疫病毒上清液进行灭活；以及
步骤(5)对所述步骤(4)灭活的口蹄疫病毒液超滤离心，收获超滤离心后的口蹄疫病毒沉淀，使用缓冲液回溶得到所述口蹄疫疫苗146S标准抗原；所述缓冲液为含有保护剂的TEN缓冲液；所述保护剂由以下浓度的组分组成：海藻糖3-15g/L、pvp5-30g/L、硫脲5-60g/L、EDTA-Na2 10-100g/L、蔗糖40-120g/L、山梨醇50-300g/L。
2.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)使用浓度为4％的二氯甲烷进行抽提纯化。
3.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中口蹄疫病毒包括牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型O/ZK/93株；所述传代细胞包括BHK-21细胞；感染复数MOI为0.05，培养24-28h收获病毒液，所述收获病毒液经冻融处理，并离心除去细胞碎片。
4.根据权利要求3所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中7000rpm离心，10℃连续离心60min除去细胞碎片。
5.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的浓缩步骤用中空纤维超滤系统对所述步骤(1)中培养的口蹄疫病毒液进行超滤，中空纤维柱截留分子量为60kd-500kd，进行10倍超滤。
6.根据权利要求5所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述中空纤维柱为截留分子量80kd的PVDF。
7.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)加入二氯甲烷后在室温下搅拌4小时，所述静置过夜的病毒液经高速冷冻离心机4℃离心。
8.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中使用1％二乙烯亚胺，于30℃灭活28小时，然后使用2％硫代硫酸钠进行37℃阻断2小时。
9.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(5)将所述灭活的口蹄疫病毒液加入到100kd超滤离心管，4℃低速水平离心机离心，3500rpm离心40min。
10.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述保护剂由以下浓度的组分组成：海藻糖7.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮10g/L、硫脲20g/L、EDTA-Na2 20g/L、蔗糖60g/L、山梨醇100g/L。
11.根据权利要求1～10任一项所述的标准抗原制备方法制备的用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原。
12.根据权利要求11所述的标准抗原在检测口蹄疫疫苗146S抗原含量中的应用。
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