[发明专利]南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法

权利要求书

1.一种南极磷虾贮藏过程中导致其品质劣化的优势菌群确定方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

1）高通量测序

从-80℃取出南极磷虾样品，解冻后用无菌水冲洗磷虾表面，然后分别置于0℃、4℃、16℃和25℃培养箱；24h后进行高通量测序；

首先提取样品总DNA，分别用细菌引物V3/V4和真菌引物ITS1/ITS2扩增，获得条带后上机测序；Miseq测序序列中含有barcode序列，以及测序时加入的引物和接头序列；首先需要去除引物接头序列，再根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads 拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据；在OTU聚类结果的基础上，获取每一个OTU聚类中的代表性序列；计算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage等物种多样性指数，并制作所有样品ACE/Chao/Shannon/Simpson/Richness指数的箱形图；基于物种分类分析，绘制物种分类条形图，物种丰度饼图，物种丰度热图；根据对已有测序微生物基因组的基因功能的构成分析结果和测序获得的物种构成，推测样本中的功能分类的构成；根据功能分类丰度，绘制功能分类条形图、丰度热图、丰度柱状图、丰度聚类树图，最终确定南极磷虾中的微生物多样性、群落结构组成及丰度；

2）平板法验证

从-80℃冰箱取出小块南极磷虾样品，解冻后用无菌水冲洗磷虾表面，各取数只分别置于0℃、4℃、16℃和25℃培养箱，24h后各取三只用匀浆器研磨，无菌水稀释，涂布，分别用6种培养基在0℃、4℃、16℃和25℃培养；

所述的6种培养基：Zobell 2216E细菌培养基，Penssay Broth细菌培养基，LB细菌培养基，SC放线菌培养基，Emerson真菌培养基，Sabouraud真菌培养基，Invitrogen基因组DNA提取试剂盒，2×Taq PCR Mastermix,酪素；

收集不同培养条件下不同培养基的平板，统计可培养菌落数量，提取菌落基因组DNA，分别用细菌和真菌的保守引物扩增，将PCR产物送测序公司测序；

采用酪素平板法检测优势菌群的蛋白酶活性；将酪素溶于pH8.0 Tris-Hcl缓冲液中，加入2%琼脂，高温高压灭菌，配制酪素平板，取可培养菌株的液体发酵液50ul加入已打孔的酪素平板，16℃培养48h；

3）两种方法的结果对比

（1）高通量测序检测南极磷虾样品中的微生物多样性和丰度均显著高于平板培养方法：

（2）南极磷虾体内和体外微生物的数量和多样性都更适于0℃-4℃生长和分布，因此在南极磷虾食品加工过程中避免在0℃-4℃长期保存；

（3）本发明方法16SrDNA高通量测序结果显示，0℃-4℃的低温贮存环境中，Enterococcus和Bacillus为优势菌群；当贮存温度上升至16℃-25℃时，Psychrobacter为优势菌群，与平板培养法的结果相同，说明南极磷虾的腐败与嗜冷杆菌相关；

（4）本发明方法ITS高通量测序结果显示，南极磷虾的优势真菌群为UnclassifiedSaccharomycete此结果表明，由于南极的特殊生境，南极磷虾中仍存在大量的有待开发的未知真菌资源；

（5）各种贮存条件的南极磷虾样品中，与氨基酸代谢和碳水化合物代谢的功能基因最多，说明南极磷虾在贮存过程中发生的自溶及腐败与其体内及体外细菌的作用正相关；

（6）优势菌群具有蛋白酶活性，说明南极磷虾的微生物与其贮存过程中的腐败过程相关。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细菌引物V3-V4为

序列F：CCTACGGGNGGCWGCAG ；序列R：GACTACHVGGGTATCTAATCC ；所述的真菌引物ITS1-ITS2 序列F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA ；序列R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC 。