[发明专利]番木瓜环斑病毒西瓜株系超表达载体的构建

说明书

本发明涉及植物病毒基因工程领域，提供了一种番木瓜环斑病毒西瓜株系超表达载体的构建技术及应用。通过基因插入重组的方式，将番木瓜环斑病毒西瓜株系山东分离物PRSV‑SD的基因组克隆到35S启动子下游，获得侵染性克隆pCamPRSV；在此基础上，将GFP基因插入pCamPRSV的NIb基因和CP基因之间，构建了能够表达外源GFP基因的超表达载体pCamPRSV‑GFP。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papayaringspot virus-Watermelon strain，PRSV-W)超表达载体的构建方法及应用。

背景技术

利用植物病毒的侵染性cDNA克隆可研究病毒的复制、移动和症状形成的机理，也可以改造为超表达载体，用来生产医用疫苗及抗体。利用病毒载体在植物体内表达外源蛋白具有产量高、费用低、无动物病原菌污染等优点，具有重要应用价值。

植物病毒载体一般用T7或CaMV 35S启动子。相比基于T7启动子的侵染性克隆，CaMV 35S启动子的侵染性克隆有诸多优点：①无需体外转录，克服了RNA酶对体外转录物降解的影响；②cDNA克隆能够以质粒形式长期保存，可用多种方法将质粒导入植物细胞核，增加侵染效率；③可通过农杆菌浸润接种，成本低廉。

PRSV-W属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，主要侵染西葫芦、西瓜、黄瓜、甜瓜等葫芦科作物，可引起寄主植物叶片褪绿、花叶、卷曲、畸形，植株矮化等症状，在果实表面形成环斑，致使产量和品质大大降低，严重时甚至绝产。目前在山东、河南、广东、四川等地均检测到PRSV侵染西葫芦、苦瓜、罗汉果等葫芦科作物，已成为危害葫芦科作物的重要病毒。本发明以PRSV-W山东分离物为材料，构建了以PRSV-W侵染性cDNA克隆为基础的超表达载体，为研究PRSV基因的功能及表达外源蛋白奠定了基础。

发明内容

本发明提供了一种PRSV-W超表达载体的构建技术及应用。通过基因插入重组的方式，将PRSV-W山东分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得了侵染性克隆pCamPRSV；在此基础上，将GFP基因插入PRSV的NIb基因和CP基因之间，构建了能够表达外源GFP基因的超表达载体pCamPRSV-GFP。

本发明实施的具体技术方案

番木瓜环斑病毒西瓜株系超表达载体的构建，具体步骤如下：

1)从PRSV-W侵染的西葫芦叶片中提取病毒粒子。

2)从病毒粒子中提取RNA，可采用常规提取方法获得。

3)以Oligo(dT)为引物进行反转录，分四段对PRSV-W基因组进行扩增，获得全序列。

4)利用同源重组的方法将PRSV-W全长cDNA分两次连接到含有35S的pCambia0390载体上，获得pCamPRSV，通过农杆菌浸润接种并观察症状。

5)利用同源重组将GFP基因插入到pCamPRSV的NIb和CP基因之间，获得了能够表达外源GFP基因的超表达载体pCamPRSV-GFP，通过农杆菌浸润接种，在紫外灯下观察绿色荧光的表达情况。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果

1)本发明采用35S启动子，可通过农杆菌浸润接种，无需体外RNA转录，降低了成本。

2)侵染性克隆pCamPRSV能稳定侵染西葫芦、西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物，发病率达100％。

3)超表达载体pCamPRSV-GFP可在西葫芦、黄瓜、西瓜、甜瓜等植株中高效表达外源蛋白。

附图说明

图1为PRSV-W侵染性克隆构建策略示意图