[发明专利]利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法

权利要求书

1.一种利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得galT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。

2.根据权利要求1所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。

3.根据权利要求2所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT通过下述方法构建得到：

制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段galTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT1-F/galT1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔgalT::SacBCm；最后，利用基因片段galTknock2转化ATCC21151ΔgalT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔgalT，至此L-苏氨酸生产所用的galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT构建完毕。

4.根据权利要求1所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。

5.根据权利要求4所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT通过下述方法构建得到：

首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段galTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT::SacBCm；最后，利用基因片段galTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT，至此L-赖氨酸生产所用的galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT构建完毕。

6.根据权利要求5所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：

利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；

以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*；

将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。

7.根据权利要求3或5所述的利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述基因片段galTknock1和galTknock2通过以下方法构建得到：

首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物galTup1-F/galTup1-R和galTdown1-F/galTdown1-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到galT基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物SacBCm-F/SacBCm-R，以质粒ploi4162为模板，PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循环30次；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC1-F/pUC1-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min；获得基因片段通过凝胶电泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除galT基因的基因片段的载体，经华大基因公司测序正确后，质粒命名为galT1；根据质粒galT1基因序列，设计引物galT1-F/galT1-R，以质粒galT1为模板PCR扩增第一次galT基因敲除的基因片段galTknock1，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，58℃20s，72℃3min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行galT基因第一轮敲除；

然后，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物galTup2-F/galTup2-R和galTdown2-F/galTdown2-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到galT基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，62℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC2-F/pUC2-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min；获得基因片段通过凝胶电泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除galT基因的基因片段的载体，经华大基因公司测序正确后，质粒命名为galT2，根据质粒galT2基因序列，设计引物galT2-F/galT2-R，以质粒galT2为模板PCR扩增第二次galT基因敲除的基因片段galTknock2，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行galT基因第二轮敲除。