[发明专利]利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种通过发酵生产L-氨基酸的方法。

背景技术

在工业上，目前L-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法，即通过具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生产能力菌株的获得是L氨基酸生产方法的核心。目前获得L氨基酸生产菌株的方法主要有两种，一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法，使其具有营养缺陷，并使其对某些代谢物产生拮抗作用，从而获得优良的工业生产菌株。

近年来随着基因工程技术的发展，重组DNA技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面，使其成为另外一种重要的获得L-氨基酸生产菌株的方法。比如，通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1305002A)；再比如，通过提高目标产品的分泌蛋白的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1260393A)；或者，通过降低某些基因的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1607246A)；在或者，通过敲除某些基因，使其失活，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1466630A)。

galT的表达产物是半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，催化UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸(半乳糖-1-磷酸)为UDP-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸，在半乳糖和葡萄糖转化中起到重要的作用。目前，对其主要研究集中在酶结构和性质方面的分析，对于其对于L-氨基酸合成还没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸产量和转化率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行修饰，使得galT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。

进一步的，采用galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。

所述galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT通过下述方法构建得到：

制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段galTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT1-F/galT1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔgalT::SacBCm；最后，利用基因片段galTknock2转化ATCC21151ΔgalT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔgalT，至此L-苏氨酸生产所用的galT基因缺失的菌株ATCC21151ΔgalT构建完毕。

进一步的，采用galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。

所述galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT通过下述方法构建得到：

首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段galTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT::SacBCm；最后，利用基因片段galTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物galT2-F/galT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT，至此L-赖氨酸生产所用的galT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔgalT构建完毕。

所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：

利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；